c-myc基因誘導成體細胞去分化的實驗研究.pdf

1、實驗目的：
　　 皮膚是人體最大的器官，位于體表，易于受傷，在皮膚創(chuàng)傷的愈合過程中，表皮細胞和成纖維細胞增殖、游走，最后覆蓋創(chuàng)面從而完成創(chuàng)面的修復。研究發(fā)現(xiàn)，干細胞在維持細胞的自我更新、保持皮膚正常的結(jié)構(gòu)和功能方面起著非常重要的作用，通過激活組織干細胞可以明顯促進創(chuàng)傷的修復過程。目前創(chuàng)傷領域的去分化研究成為熱點，目前已經(jīng)有研究證實了創(chuàng)傷過程中的去分化現(xiàn)象，同時最新的研究也證實了體外培養(yǎng)的細胞能夠在一定條件下轉(zhuǎn)化成為多能干細胞，這

2、對創(chuàng)傷愈合的研究有著積極的促進作用。目前干細胞的來源面臨著很多倫理問題，如何取得足夠的人干細胞是干細胞研究的一個主要問題，如果能將成體細胞通過去分化誘導成為前體細胞，就可以避免應用胚胎干細胞帶來的倫理問題。
　　 目前有很多研究已經(jīng)注意到了干細胞與腫瘤細胞的相似之處。腫瘤細胞與干細胞都是低分化的細胞，而且兩者都有很快的生長增殖速度。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤形成的信號通路在去分化的過程中可能起著非常重要的作用，因此我們選擇原癌基因做為研究對

3、象。C-myc被認為是與去分化過程關(guān)系最為密切的原癌基因，一方面c-myc是許多腫瘤信號通路的靶基因，同時c-myc在創(chuàng)傷愈合過程以及一些去分和轉(zhuǎn)分化的過程中均有明顯的表達。而成纖維細胞是構(gòu)成皮膚的主要細胞，被認為是一種終末分化的細胞，在創(chuàng)傷修復的過程中成纖維細胞起著非常重要的作用，同時成纖維細胞也是構(gòu)成瘢痕的最主要細胞。正因為如此，目前創(chuàng)傷修復和瘢痕的研究都把成纖維細胞的增殖和凋亡作為研究的重點。
　　 本實驗通過向成纖維細胞

4、中轉(zhuǎn)染基因以改變細胞基因表達的方法觀察體外培養(yǎng)的細胞所產(chǎn)生的去分化現(xiàn)象，在此基礎上對去分化現(xiàn)象產(chǎn)生的機制進行初步的探討，同時在動物模型上進一步觀察這種現(xiàn)象的存在，為皮膚創(chuàng)傷研究提供理論基礎。
　　 實驗方法：
　　 1、原癌基因c-myc轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞
　　 培養(yǎng)正常生長的NIH3T3細胞，然后通過脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染成纖維細胞，將原癌基因c-myc導入NIH3T3細胞中，然后應用G418篩選轉(zhuǎn)染成功的細胞，觀

5、察轉(zhuǎn)染后細胞的生長情況，同時檢測細胞的增殖能力以及細胞周期的變化。應用免疫細胞化學，流式細胞儀檢測以及western blotting等多種方法來檢測c-myc的表達和成纖維細胞標志物波形蛋白的改變情況。
　　 2、培養(yǎng)正常生長的轉(zhuǎn)染成功表達c-myc原癌基因的NIH3T3細胞，對wnt信號通路中一些特異性蛋白進行檢測，如wnt4蛋白，β-catenin，同時與轉(zhuǎn)染前的細胞表達相比較，觀察wnt信號通路在成纖維細胞去分化過程中所

6、起的作用。
　　 3、制作鼠的動物損傷創(chuàng)面，將原癌基因c-myc質(zhì)粒應用于創(chuàng)面周圍，觀察創(chuàng)面的愈合情況，同時在不同時間點取創(chuàng)面周圍組織進行檢測，對標本進行HE染色和c-myc， PCNA的免疫組織化學染色。
　　 4、統(tǒng)計學分析:實驗組和對照組指標采用t檢驗和方差分析進行統(tǒng)計學處理，各項指標以均數(shù)±標準差表示，p＜0.05表示有顯著差異。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.應用c-myc原癌基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3

7、T3細胞取得成功，經(jīng)過G418篩選后可以得到具有c-myc表達的成纖維細胞，轉(zhuǎn)染效率大約為10％左右，轉(zhuǎn)染后的細胞生長增殖能力較轉(zhuǎn)染前明顯增強，同時轉(zhuǎn)染后的細胞S期比例明顯增高。G1期比例明顯減少，同時轉(zhuǎn)染后的細胞可以穩(wěn)定表達c-myc，經(jīng)過westren blotting，免疫組織化學，以及流式細胞儀檢測，可見成纖維細胞的標志物波形蛋白消失?？梢哉J為通過改變成體細胞的基因序列，細胞增殖速度明顯增快，細胞的表型發(fā)生改變，初步證明了去分化

8、現(xiàn)象的存在。
　　 2.純化已經(jīng)轉(zhuǎn)染成功的NIH3T3細胞，繼續(xù)進行培養(yǎng)，檢測wnt信號通路相關(guān)的蛋白在轉(zhuǎn)染成功的細胞中的表達情況，并與轉(zhuǎn)染前的細胞進行對比，可以發(fā)現(xiàn)wnt4蛋白，β-catenin的表達均明顯增強，這表明wnt信號通路在成纖維細胞去分化的過程中起著一定的作用。
　　 3.應用c-myc原癌基因質(zhì)粒的鼠的創(chuàng)面愈合速度較對照組創(chuàng)面明顯增快，通過對創(chuàng)面周圍組織定期取材免疫組化研究可以發(fā)現(xiàn)，c-myc表達的維持

9、時間延長，隨著創(chuàng)面的逐漸愈合，c-myc的表達逐漸消失，這與正常的創(chuàng)面愈合過程相同。同時實驗組創(chuàng)面的PCNA表達也明顯增強，通過此實驗可以證明應用c-myc所形成的細胞為非惡性增殖細胞，可以認為是可以促進創(chuàng)傷愈合的具有去分化性質(zhì)的細胞。
　　 結(jié)論：
　　 1、c-myc原癌基因質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，細胞可以持續(xù)表達c-myc，細胞生長增殖速度明顯增快，同時細胞的表型發(fā)生了變化，可以認為成纖維細胞發(fā)生了去分化，提