基于OcT-4、Sox2、Klf4和C-Myc基因克隆的東北虎體細(xì)胞重編程研究.pdf

1、作為生物多樣性保護(hù)的一個(gè)重要內(nèi)容，拯救和保護(hù)瀕危物種已經(jīng)成為一個(gè)世界性的重大課題，虎(Panthera tigris)作為全球野生動(dòng)物保護(hù)的旗艦種，已日益得到人們的高度關(guān)注。東北虎(P.t.altaica)是現(xiàn)存虎亞種中個(gè)體最大者，處于東北森林生態(tài)系統(tǒng)食物鏈頂級(jí)，在其棲息的自然生態(tài)系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用。然而，由于人類的直接獵殺和生存環(huán)境的破壞，東北虎野生種群數(shù)量銳減，目前野生東北虎只分布在俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)及中國東北部分地區(qū)。在恢復(fù)東北

2、虎野外種群及其棲息地的同時(shí)，如何運(yùn)用現(xiàn)代細(xì)胞與分子生物學(xué)新技術(shù)開展其遺傳資源的離體保護(hù)，已成為國內(nèi)外虎保護(hù)研究中新的熱點(diǎn)。本研究通過對(duì)東北虎的成纖維細(xì)胞系構(gòu)建、BAC文庫構(gòu)建、特異組織高通量轉(zhuǎn)錄組測序分析、全能性基因克隆及慢病毒載體構(gòu)建、成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多能性干細(xì)胞等一系列研究，主要獲得了以下研究成果:
　　1、采用貼壁培養(yǎng)法和冷凍生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了東北虎成纖維細(xì)胞系，對(duì)所建細(xì)胞系質(zhì)量與生物學(xué)特性研究結(jié)果表明:體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞形態(tài)

3、良好，均為典型的長梭型;凍存與復(fù)蘇后細(xì)胞生長經(jīng)歷了潛伏期、指數(shù)增長期和平臺(tái)期，生長曲線呈典型“S”型，細(xì)胞群體倍增時(shí)間約為30 h;細(xì)菌、真菌、病毒和支原體等微生物檢測均呈陰性;乳酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶兩種同工酶酶譜均具種屬特異性，無物種間的交叉污染;二倍體細(xì)胞比率為97.83％;6種熒光蛋白基因在細(xì)胞中的表達(dá)率為9.81％～23.19％;東北虎成纖維細(xì)胞系的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到美國典型培養(yǎng)物中心(American type Culture

4、Collection，ATCC)細(xì)胞系鑒定標(biāo)準(zhǔn)。
　　2、應(yīng)用低熔點(diǎn)瓊脂糖法提取東北虎基因組DNA，T4 DNA連接酶構(gòu)建BAC載體，電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建包含153600個(gè)BAC克隆、覆蓋率為6.5倍的東北虎BAC文庫，其平均插入片段長度為116.5kb，其中空克隆的比例為2.6％，所建東北虎基因組BAC文庫可以滿足后續(xù)的功能基因克隆和物理圖譜構(gòu)建等研究。
　　3、應(yīng)用高通量de novo轉(zhuǎn)錄組測序?qū)|北虎肺及胎盤組織總RNA進(jìn)行測

5、序分析，獲得9.2GB的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)長度在548 bp-575bp的基因80624條，大約48.3％的基因序列可以在數(shù)據(jù)庫(Nr, Swiss-port，KEGG和COG)中被注釋;獲得大量的東北虎編碼基因，并將編碼基因完成注釋后進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)東北虎大量編碼基因與家貓基因高度同源;通過GO與Pathway分析，闡述了部分編碼基因在特異組織中的網(wǎng)絡(luò)功能;同時(shí)獲取了東北虎全能基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc mRNA序列，為

6、體細(xì)胞重編程提供理論依據(jù)。
　　4、應(yīng)用PCR技術(shù)體外克隆東北虎全能基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，并與慢病毒載體Lv-efl a-eGFP-tre-X連接構(gòu)建慢病毒過表達(dá)載體，提取質(zhì)粒后利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中進(jìn)行包裝、收集和濃縮，經(jīng)病毒滴度測定獲得了較高的病毒滴度1.1×108 TU/ml。
　　5、應(yīng)用慢病毒侵染法將東北虎Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因轉(zhuǎn)基因到東北虎成纖維細(xì)胞中

7、并穩(wěn)定表達(dá)，在誘導(dǎo)14d后獲得iPS克隆，對(duì)獲得的iPS細(xì)胞通過細(xì)胞免疫熒光、Western Blot驗(yàn)證干細(xì)胞表面標(biāo)志物Oct-4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-80的表達(dá);染色體核型分析研究東北虎iPS細(xì)胞在重編程過程中沒有出現(xiàn)遺傳變異;real time PCR分析東北虎iPS細(xì)胞在重編程過程中Oct-4、Sox2、 Nanog、 TERT、Bax、Bcl-xl和P5

8、3的表達(dá)情況;堿性磷酸酶染色分析證實(shí)東北虎iPS細(xì)胞高表達(dá)堿性磷酸酶;注射免疫缺陷小鼠形成的畸胎瘤證實(shí)東北虎iPS細(xì)胞體內(nèi)分化能力;三個(gè)胚層的體外定向誘導(dǎo)分化證實(shí)東北虎iPS細(xì)胞具有體外分化能力。
　　綜上所述，本研究通過高通量測序獲得的東北虎Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體，并在東北虎成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)后誘導(dǎo)東北虎成纖維細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，并具備了全能干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，成功地構(gòu)建了東北虎iPS