去分化脂肪細胞向起搏細胞的誘導分化.pdf

1、目前治療病態(tài)竇房結綜合征、房室傳導阻滯等緩慢型心率失常的主要方法仍是安裝電子心臟起搏器，但電子心臟起搏器存在的諸多缺陷限制了它的應用，因此心臟生物起搏器構建已經(jīng)成為生物起搏研究的熱點。
　　 當前心臟生物起搏器的構建方法主要有基因治療、細胞移植和組織工程化構建等方法?；蛑委煷嬖谕庠椿螂y以在體內(nèi)長期穩(wěn)定表達和有效調(diào)控，缺乏高效、安全、導向性好的載體等問題。細胞移植和組織工程化構建可以較好的避免基因轉(zhuǎn)染的缺點。細胞移植和組織工程

2、化構建都涉及到種子細胞的問題。
　　 目前用于心臟生物起搏器研究較多的種子細胞為：胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)、誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS)、心臟來源的細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)等，這些種子細胞都存在一定的缺陷，因此尋找更合適的種子細胞仍是

3、心臟生物起搏器構建的瓶頸問題。
　　 去分化脂肪(dedifferentation fat，DFAT)細胞由于其易獲得、多向分化潛能及自體可取得優(yōu)勢，已經(jīng)引起許多研究學者的注意。DFAT細胞是由成熟脂肪細胞逐漸脫脂去分化而成，具有間充質(zhì)干細胞的表型，而且具有多向分化潛能，在體外可以分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞和神經(jīng)細胞等。
　　 Jumabay等在對小鼠DFAT細胞給予20％胎牛血清誘導培養(yǎng)14天后，出現(xiàn)一些

4、自發(fā)跳動的心肌樣細胞，具有起搏細胞的4期自動除極化的電生理特征，為構建心臟生物起搏器帶來了新的希望。但是由于小鼠心臟太小，難以進行心臟生物起搏器的在體研究。因此，有必要對更大型動物進行研究。但用與心肌細胞共培養(yǎng)等方法誘導大鼠DFAT細胞，細胞表達心肌細胞的表面標志，有肌管樣結構形成，可并未觀察到有細胞具有自主搏動。因此，能否將大鼠等來源的DFAT細胞誘導為起搏細胞還需要進一步的探討。
　　 本實驗擬選用大鼠來源的DFAT細胞為種

5、子細胞，采用5-AZA誘導和與竇房結細胞共培養(yǎng)的方法，探討能否在體外誘導DFAT細胞分化為起搏樣細胞，旨在為心臟生物起搏器的構建提供一種來源廣泛、可來源于自體、無免疫排斥反應，且活性好的種子細胞。
　　 第一部分DFAT細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 研究目的：分離培養(yǎng)獲得大鼠DFAT細胞，并進行鑒定，以獲取可向起搏樣細胞誘導分化的種子細胞。
　　 材料和方法：經(jīng)膠原酶消化獲得的成熟脂肪細胞，經(jīng)天花板培養(yǎng)法使成熟脂

6、肪細胞去分化，觀察去分化過程細胞形態(tài)的變化，用透射電鏡檢測細胞的超微結構。取生長良好的DFAT細胞做免疫細胞化學檢測CD13、CD29、CD31、CD34和CD44的表達情況，并對DFAT細胞進行成脂誘導分化和成骨誘導分化以檢測DFAT細胞的多向分化潛能。
　　 結果：成熟脂肪細胞可以在天花板培養(yǎng)法的培養(yǎng)條件下去分化為成纖維樣的DFAT細胞，透射電鏡結果顯示細胞內(nèi)含豐富的高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，說明細胞具有較高的蛋白合成能力，細胞活力

7、旺盛。經(jīng)免疫細胞化學檢測，DFAT細胞表達CD13、CD29、CD44，不表達CD31和CD34，具有一定的間充質(zhì)干細特性。體外多向分化潛能結果顯示，成脂誘導后油紅O染色可見紅色脂滴；成骨誘導后茜素紅染色可見鈣鹽沉積，證明獲得的DFAT細胞具有多向分化潛能。
　　 結論：通過天花板培養(yǎng)法成功分離、培養(yǎng)了DFAT細胞。
　　 第二部分5-AZA對DFAT細胞的誘導分化
　　 研究目的：探討5-AZA誘導DFAT細胞

8、分化為起搏樣細胞的可能性。
　　 材料與方法：用10μmol/L的5-AZA誘導DFAT細胞，分別在1周、2周、3周用PCR檢測誘導后細胞起搏相關基因的表達；在3周時免疫細胞化學檢測起搏相關標志物的表達情況；利用與靜息心肌共培養(yǎng)的方法，檢測其起搏功能。
　　 結果：DFAT細胞經(jīng)5-AZA誘導后細胞變大，突起增多，誘導后3周透射電鏡下可見有肌節(jié)樣結構和較多的縫隙連接。誘導后細胞心臟早期標志基因Nkx2.5、GATA-4先

9、上調(diào)后下降，Tn、Cx和HCN基因隨著誘導時間的延長表達逐漸升高，免疫細胞化學顯示誘導后細胞可表達心肌肌鈣蛋白TnT和TnI，縫隙連接蛋白Cx43和Cx45，以及起搏通道蛋白HCN2、HCN4。與靜息心室肌共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-AZA誘導的DFAT細胞并不能驅(qū)動靜息的心室肌搏動。
　　 結論：5-AZA可以誘導DFAT分化為具有一定起搏細胞表型的細胞，但并不具備起搏細胞的功能。
　　 第三部分與竇房結細胞共培養(yǎng)對DFAT的誘導

10、分化
　　 研究目的：探討與竇房結細胞共培養(yǎng)誘導DFAT細胞分化為起搏樣細胞的可能性。
　　 材料與方法：用差速貼壁結合BrdU法分離新生鼠竇房結細胞，再接種于Transwell小室內(nèi)，在6孔培養(yǎng)板中接種DFAT細胞，最后將Transwell小室插入6孔板中，使DFAT細胞與竇房結細胞間接接觸共培養(yǎng)，分別在1周、2周、3周用PCR檢測相關基因的表達；在誘導3周時用免疫細胞化學檢測相關蛋白的表達；利用與靜息心肌共培養(yǎng)的方法

11、，檢測其起搏功能。
　　 結果：經(jīng)與竇房結細胞共培養(yǎng)后，DFAT細胞逐漸變大，可見肌管樣細胞，透射電鏡下可見明顯肌節(jié)結構，且存在較豐富的連接，在與竇房結細胞共培養(yǎng)過程中，誘導后細胞心臟早期標志基因Nkx2.5、GATA-4先上調(diào)后下降，Tn、Cx和HCN基因隨著誘導時間的延長表達逐漸升高，免疫細胞化學顯示誘導后細胞表達心肌肌鈣蛋白TnT和TnI，縫隙連接蛋白Cx43和Cx45，以及起搏通道蛋白HCN2、HCN4。與靜息心室肌共培