脂肪成體干細胞定向誘導(dǎo)分化為軟骨細胞的實驗研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨的損傷和缺損是骨科常見的問題之一。關(guān)節(jié)軟骨再生及自我修復(fù)能力極為有限，而傳統(tǒng)的治療方法如磨削術(shù)、鉆孔微骨折術(shù)等均存在一定的缺陷，遠期療效不甚理想。近年來組織工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一難題帶來了新的希望，有望成為治療軟骨損傷的新方法。軟骨組織工程就是將種子細胞接種到合適的生物支架材料上，在體外誘導(dǎo)后或者直接植入體內(nèi)修復(fù)軟骨缺損。因此，種子細胞及生物支架材料在組織工程軟骨的構(gòu)建中有著舉足輕重的地位。 目的：從兔脂肪組織中分離出

2、脂肪成體干細胞（ADASCs），體外經(jīng)原代及傳代培養(yǎng)后，在轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）存在的條件下，對比觀察不同濃度的血清對ADASCs向軟骨細胞增殖和分化的影響，探索較為合適的血清濃度；再將穩(wěn)定傳代后的ADASCs種植于纖維蛋白膠/透明質(zhì)酸（FG/HA）復(fù)合支架上，在含TGF-β1的軟骨誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，體外構(gòu)建ADASCs、纖維蛋白膠/透明質(zhì)酸及轉(zhuǎn)化生長因子的組織工程軟骨模塊，探討FG/HA作為軟骨組織工程支架材料的可行性。

3、 方法： 1、ADASCs 在不同的血清濃度下向軟骨細胞分化：取成年新西蘭兔頸部脂肪組織，剪碎后通過I 型膠原酶消化，得到脂肪成體干細胞；穩(wěn)定傳代后，分別用含1％、10％ FBS 的軟骨誘導(dǎo)液干預(yù)ADASCs 2 周，采用MTT檢測方法對細胞增殖活性進行比較，應(yīng)用甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色進行軟骨細胞鑒定，利用Leica 病理圖像軟件分析兩組間Ⅱ型膠原免疫組化染色后的灰度，比較兩組細胞分化的效果。 2、TG

4、F-β1誘導(dǎo)ADASCs體外構(gòu)建改良纖維蛋白膠軟骨模塊：取傳3 代的ADASCs，消化、離心后，棄上清液，實驗組（FG/HA組）加入100μL 纖維蛋白膠（FG）催化劑液，將細胞與之混勻，再分別加入200μL 透明質(zhì)酸（HA）及100μL FG 主體膠液，充分混勻，待其在室溫下成凝膠狀后移入24 孔培養(yǎng)板中，加入誘導(dǎo)液培養(yǎng)。對照組（FG組）中不加HA，只加入200μLFG 催化劑液和200μL主體膠液，其它操作同實驗組。倒置顯微鏡逐日觀

5、察兩組細胞生長情況以及支架降解情況；第14 d取出標本，2.5％戊二醛固定，掃描電鏡下分別觀察FG組及FG/HA組細胞與支架材料復(fù)合情況；10％中性甲醛溶液固定其余標本，石蠟包埋，切片，行HE染色、甲苯胺藍染色，免疫組化法檢測Ⅱ型膠原的表達。 結(jié)果：MTT 檢測顯示10％FBS 組細胞增殖活性高于1％FBS 組（P<0.05），兩組細胞的甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽性，并以10％FBS組更為顯著；灰度分析提示10％F

6、BS 組Ⅱ型膠原表達量高于1％FBS 組（P<0.05）。脂肪成體干細胞在支架內(nèi)呈多層的三維生長，形態(tài)為圓形，增殖活性高。誘導(dǎo)培養(yǎng)后，兩組支架材料均有降解，但實驗組較對照組的降解速度明顯減慢。掃描電鏡可見FG/HA 復(fù)合支架呈三維立體多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率較高，細胞與支架材料附著情況良好。石蠟切片HE 染色可見類似正常軟骨的組織學(xué)特征，甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性，實驗組的陽性染色程度較高。 結(jié)論：在體外單層培養(yǎng)的條件下，A