蠟梅過氧化物酶體生成蛋白基因CpPEX22的克隆及功能初步分析.pdf

1、過氧化物酶體生成蛋白(peroxisomegenerateprotein)是參與過氧化物酶體生物發(fā)生的一類蛋白質(zhì)，這類蛋白總稱為peroxin，其編碼基因?qū)懽鱌EX。目前鑒定的peroxin已超過30個(gè)。Peroxins參與過氧化物酶體的分裂，增殖以及過氧化物酶體膜蛋白與基質(zhì)蛋白的運(yùn)輸機(jī)制。有研究表明，PEX22p(PEX22基因編碼的蛋白)是作為過氧化物酶體膜上PEX4p的錨定位點(diǎn)。PEX5p是過氧化物酶體基質(zhì)蛋白運(yùn)輸過程中定位信號(hào)P

2、TS1的受體蛋白。PEX22p和PEX4p共同作用，降低PEX5p的破壞或修改，保護(hù)PEX5p免受一些一般性的蛋白水解機(jī)械的降解，從而使得它可以循環(huán)參與過氧化物酶體基質(zhì)蛋白的運(yùn)輸。過氧化物酶體普遍存在于真核生物的各類細(xì)胞中，含有豐富的酶類，主要是氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶。過氧化氫(H2O2)是氧化酶催化的氧化還原反應(yīng)中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性物質(zhì)，過氧化物酶和過氧化氫酶都存在于過氧化物酶體中，從而對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。所以PEX2基因與過氧化物

3、酶體的生物發(fā)生，抗氧化與抗衰老作用有關(guān)。
　　 過氧化物酶體氧化代謝的變化是植物衰老的一種表現(xiàn)。本研究是從探索蠟梅過氧化物酶體生成蛋白基因PEX22的功能特性出發(fā)，以本實(shí)驗(yàn)室眭順照構(gòu)建的蠟梅cDNA文庫為材料，隨機(jī)克隆了該基因，并命名為CpPEX2。然后對(duì)該基因在蠟梅不同組織以及脅迫反應(yīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析;通過構(gòu)建植物超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草來分析該基因的功能。主要的研究結(jié)果有:
　　 1.CpPEX22基因及編碼蛋白的生

4、物信息學(xué)分析
　　 CpPEX22的cDNA基因全長1207bp，其中含有804bp的開放閱讀框，其中G+C％為44.65％。編碼一個(gè)由268個(gè)氨基酸殘基組成的過氧化物酶體生成蛋白，不含內(nèi)含子。運(yùn)用生物信息學(xué)的手段對(duì)CpPEX22基因編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與性質(zhì)進(jìn)行了分析，CpPEX22編碼的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由占總蛋白46.82％的隨機(jī)卷曲(Radomcoil)、41.95％的α螺旋(Alphahelix)以及含量為11.24％的

5、延伸鏈(Extendstrand)組成;不含信號(hào)肽序列;共有17個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包含有15個(gè)絲氨酸（Serine）磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)蘇氨酸（Thremnine）磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位點(diǎn);含有跨膜結(jié)構(gòu);主要定位在在線粒體膜間，線粒體基質(zhì)，核以及葉綠體類囊體膜。
　　 2.CpPEX22基因轉(zhuǎn)錄水平分析
　　 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明:CpPEX22基因在蠟梅不同組織中均有不同程度的表達(dá)，在老葉中表

6、達(dá)量最多;在3輪花器官中的差異也十分顯著，中瓣表達(dá)量最高;CpPEX22基因在蠟梅花開放過程中衰敗期的表達(dá)量最高;高溫、低溫、H2O2、ABA等非生物脅迫處理后，CpPEX22基因在蠟梅幼苗葉片中的表達(dá)模式有所不同，H2O2、ABA處理可誘導(dǎo)CpPEX22的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄水平的分析結(jié)果說明CpPEX22可能在蠟梅葉片與蠟梅花的衰老及非生物脅迫應(yīng)答的過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 3.在煙草中超表達(dá)CpPEX22基因
　　 通