鹽芥谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GlutathionePeroxidases，GPXs)是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的重要酶類之一。植物GPXs起步較晚，而對(duì)一種植物中GPXs整個(gè)家族的研究更少，只在模式植物擬南芥、豆科植物百脈根、木本植物楊樹中進(jìn)行了較為系統(tǒng)地研究，關(guān)于鹽生植物鹽芥中GPXs的系統(tǒng)研究未見報(bào)道。
　　 本研究以鹽芥(Thellungiellasalsuginea)為材料，進(jìn)行了ThGPXs基因的克隆、序列的生物信息學(xué)分析、高

2、鹽和干旱脅迫下的表達(dá)模式分析，選取ThGPX6進(jìn)行了亞細(xì)胞定位研究，獲得的結(jié)論如下:
　　 1.依據(jù)鹽芥EST序列和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，運(yùn)用電子克隆、RACE技術(shù)克隆得到ThGPXs的8個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)序列，依次命名為ThGPX1～ThGPX8。對(duì)其推測(cè)的氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸數(shù)目介于167～236之間，分子量在18.9～26.3kDa之間，ThGPX2和ThGPX8為酸性蛋白，ThGPX3為中性蛋白，其他的均為堿

3、性蛋白。
　　 2.對(duì)ThGPXs的基因組分析結(jié)果表明，ThGPXs的CDS序列與基因組釋放的序列完全一致，但是UTR區(qū)的序列不盡相同。ThGPXs每個(gè)家族成員的ORF區(qū)域均由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)符合真核生物GT-AG規(guī)則。UTR可占用單獨(dú)的外顯子。外顯子的長(zhǎng)度具有高度保守性，三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域在外顯子上的位置具有保守性。不同ThGPXs的順式作用元件不盡相同，除了含有光響應(yīng)相關(guān)的元件外，主要含有激素響應(yīng)和非

4、生物脅迫響應(yīng)元件。
　　 3.生物信息學(xué)分析表明，ThGPXs的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)卷曲為主，β-折疊片較少，靠近C末端多為α-螺旋結(jié)構(gòu)。ThGPXs的三級(jí)結(jié)構(gòu)以二聚體形式存在，主要的差異點(diǎn)位于α-螺旋處。ThGPXs的8個(gè)成員皆有潛在的磷酸化位點(diǎn)，ThGPX6的總數(shù)最高。只有ThGPX3存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，推測(cè)為分泌蛋白;采用PSORT進(jìn)行ThGPXs的亞細(xì)胞定位分析，各成員的亞細(xì)胞定位不同:ThGPX2分布于細(xì)胞質(zhì)中，ThGP

5、X3分布于細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，ThGPX6分布于線粒體中，ThGPX1、ThGPX7、ThGPX8分布于葉綠體中。
　　 4.采用熒光定量PCR分析結(jié)果表明，不同處理?xiàng)l件下或同一處理?xiàng)l件下不同組織中，ThGPXs的表達(dá)量不同，不同組織中不同基因響應(yīng)不同類型的脅迫。300mmol/LNaC1處理引起根中的ThGPXs的表達(dá)量升高，24h達(dá)到最高水平。除了ThGPX7外，20％PEG6000脅迫處理48h能夠引起根中ThGPXs各成

6、員的上調(diào)表達(dá)。
　　 5.采用GFP構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行ThGPX6亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ThGPX6存在于線粒體中，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，提示ThGPX6在清除ROS過(guò)程中起著重要作用。
　　 本研究對(duì)ThGPXs的結(jié)構(gòu)和功能有了一定的了解，但是GPXs的抗逆作用機(jī)理尚不清楚。另外，在自然環(huán)境下，植物通常受到多重脅迫刺激，比如干旱刺激伴隨著高溫、強(qiáng)光刺激等，深入研究植物GPXs在逆境脅迫下的抗氧化功能還存在著局限性，有待于進(jìn)一