沙眼衣原體Ahpc基因克隆表達(dá)及過(guò)氧化物酶活性分析.pdf

1、目的：研究沙眼衣原體（Ct）感染是否引起巨噬細(xì)胞氧化損傷，分析 Ct0866（烷基氫過(guò)氧化物還原酶，Ahpc）基因在感染過(guò)程中的表達(dá)及其在Ct抗氧化脅迫中起作用，為了解Ct的抗氧化機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：將Ct感染巨噬細(xì)胞，并在0h、3h、6h、9h和12h收集細(xì)胞，熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) ROS的水平， Realtime-PCR檢測(cè)Ahpc基因在感染不同時(shí)間的變化情況。以Ct DNA為模板，PCR法擴(kuò)增Ahpc基因，將其克隆到p

2、ET28a載體。經(jīng)鑒定后將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E.coli BL21，利用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。采用SDS-PAGE對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析并純化重組Ahpc蛋白；采用氧化鐵二甲酚橙法檢測(cè)Ahpc蛋白的氫過(guò)氧化物酶活性。測(cè)定Ahpc蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)基因菌和對(duì)照菌在百草枯脅迫下的生長(zhǎng)曲線。
　　結(jié)果：
　?。?）熒光結(jié)果顯示Ct感染能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS，發(fā)現(xiàn)在3h時(shí)候其熒光值為1980±310，6h的熒光值為4260±350并且達(dá)

3、到高峰，在9h時(shí)為2900±245，12h時(shí)為2100±250。
　　（2）Ct感染過(guò)程中，Ahpc基因的表達(dá)上調(diào)，在3h時(shí)為初始的7.3倍，6h為初始的8.2倍，達(dá)到了高峰，然后開(kāi)始下降，9h時(shí)為初始的5.2倍，12h為4.5倍。
　?。?）成功擴(kuò)增獲得大小為588 bp的Ahpc基因，所構(gòu)建的原核重組質(zhì)粒pET28a-Ahpc經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定與預(yù)期目的基因相符。
　?。?）利用IPTG成功誘導(dǎo)Ahpc蛋白的表達(dá)，

4、SDS結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組菌能夠表達(dá)分子約為26kDa的蛋白質(zhì)，并通過(guò) Ni2+親和層析法純化獲得純度較高的重組Ahpc蛋白。
　　（5） Ahpc蛋白能夠降解叔丁基過(guò)氧化氫（t-BHP）和 H2O2。（6）在百草枯引起的氧化應(yīng)激條件下，轉(zhuǎn)化pET28a-Ahpc表達(dá)載體的大腸桿菌生長(zhǎng)要強(qiáng)于對(duì)照菌（轉(zhuǎn)化了空載體pET28a）。
　　結(jié)論： Ct感染會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激；Ahpc在 Ct感染過(guò)程中表達(dá)上調(diào)；Ahpc蛋白具有氫過(guò)氧