抗CD20人源化抗體的制備及生物學(xué)活性鑒定.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文抗CD20人源化抗體的制備及生物學(xué)活性鑒定姓名：吳蘭申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：趙健20090601為了進(jìn)一步減小嵌合抗體的免疫原性，我們利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)對CD20單抗3D9進(jìn)行人源化改造。在確定了3D9可變區(qū)中CDR區(qū)和Frameworkregion(FR)區(qū)的范圍之后，我們將CDR區(qū)直接移植到人源抗體模板的FR中，構(gòu)建CDR移植抗體，并將獲得的人源化輕、重鏈抗體基因克隆到表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞

2、，用流式細(xì)胞術(shù)測定其抗原結(jié)合活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這個(gè)人源化抗體的親和力基本完全喪失。為了重建人源化抗體的親和力，我們利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)對可能影響抗體親和力的FR區(qū)重要?dú)埢M(jìn)行回復(fù)突變分析，分別構(gòu)建了5條不同的人源化重鏈和5條不同的人源化輕鏈，經(jīng)過活性篩選，我們發(fā)現(xiàn)對于人源化重鏈來說，框架區(qū)殘基27，30，43，48，67，69，7l，73的回復(fù)突變是必要的，將它們?nèi)客蛔優(yōu)槭笤礆埢蟮玫搅艘粋€(gè)活性幾乎等于嵌合抗體重鏈的人源化重鏈3D9VHb。

3、我們采用同樣的方法對人源化輕鏈基因進(jìn)行改造，發(fā)現(xiàn)將輕鏈框架區(qū)殘基3，4，49全部回復(fù)突變獲得的人源化輕鏈3D9VLb與3D9VHb組成的人源化抗體H3D9的抗原結(jié)合活性幾乎等同于嵌合抗體C3D9，在篩選得到高親和力的人源化抗體H3D9之后，我們建立了高效表達(dá)H3D9的CHOK1細(xì)胞株。競爭抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此人源化抗體它能與鼠源親本抗體競爭結(jié)合Raji細(xì)胞，證實(shí)它保留了與鼠源抗體相似的親和力和特異性，表明H3D9是一個(gè)改造成功的人源化抗體