高親和力人源化抗CD20抗體的構建及生物學功能研究.pdf

1、非霍奇金淋巴瘤是一種常見的B細胞型淋巴瘤。現(xiàn)代醫(yī)療技術中的放化療技術已經(jīng)不能滿足人類迫切治療該類疾病的渴求，而具有靶向治療機制的單克隆抗體方法開始被人們廣泛研究和應用。研究發(fā)現(xiàn)CD20分子表達于NHL細胞表面，則此分子是靶向治療的理想靶點。利妥昔單抗（Rituxiamb)是第一個被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準上市并用于治療NHL的單抗藥物。但因Rituximab分子中含有30％的鼠源序列，患者在長期用藥以后，易引起人抗鼠抗體免疫

2、應答（HAMA)而產(chǎn)生嚴重的不良反應。同時，Rituximab的臨床反應率只有50%，完全緩解率僅有10%。因此，嚴重制約了Rituximab在臨床中的長期應用。針對這一現(xiàn)象，人們開始對Rituximab進行改造，有的用與鼠源序列相似的人骨架區(qū)來替換Rituximab中的鼠源框架區(qū)，有的用提高Rituximab的親和力來加強抗腫瘤活性。如將兩者同時進行改造，則殺傷腫瘤細胞的效果有可能比只是改造其中一方面的效果要好。
　　目的：改造

3、新型的抗體可以從親和力和免疫原性兩方面進行，可通過提高親和力來增加抗原與抗體的識別和結合，對于免疫原性主要是通過降低抗體中的鼠源序列來減少在人體內的抗性。本文旨在構建較高親和力和較低免疫原性的CD20抗體，并驗證是否具有相應的生物學活性。
　　方法：⑴通過專利分析，進行高親和力和人源化的設計改造，將CD20H和CD20L分別克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1/ZEO(+)中去，利用轉染試劑jetPEI將輕重

4、鏈表達載體共轉染中國倉鼠卵巢細胞CHO-K1，通過有限稀釋法進行單克隆細胞株的篩選，通過逆轉錄PCR檢測mRNA，ELISA檢測表達量，并將貼壁細胞馴化成懸浮培養(yǎng)。⑵利用流式細胞術檢測細胞上清與CD20陽性細胞Raji的結合活性，并對其生物學功能進行檢測，如細胞殺傷活性、ADCC效應以及CDC效應。
　　結論：獲得了目的抗體輕鏈和重鏈的基因，構建重組表達載體pcDNA3.1/ZEO(+)-CD20L和pcDNA3.1(+)-CD2