新型人源化抗CD20抗體的設(shè)計(jì)及生物學(xué)功能研究.pdf

1、非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin's lymphoma，NHL）是最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，絕大多數(shù)NHL發(fā)生與B細(xì)胞相關(guān)，NHL是威脅人類生命的10大惡性腫瘤之一，許多傳統(tǒng)的化療藥物對(duì)NHL的治療效果并不好。利用單克隆抗體靶向治療惡性腫瘤是人類長久以來的夢想。
　　 1997年，世界上第一個(gè)抗CD20單克隆抗體——美羅華(Rituximab)上市應(yīng)用于NHL的治療，之后隨著美羅華的廣泛應(yīng)用，NHL的死亡率得到控制并逐漸下

2、降。在之后的10年時(shí)間里，人們摸索出了多種基于美羅華的治療方案，旨在提高美羅華功效，取得了長足的進(jìn)步，使得NHL患者的緩解率和完全緩解率有所提高，并且預(yù)后良好。美羅華的成功最重要的因素就是其選用了一個(gè)合適的治療靶標(biāo)—CD20。CD20是B淋巴細(xì)胞上的跨膜蛋白，由279個(gè)氨基酸組成，以非糖基化形式存在，其分子量因磷酸化程度不同而不同，范圍在33～37 kD。CD20分子有4個(gè)跨膜區(qū)，氨基端和羧基端都位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)側(cè)，在第三跨膜區(qū)和第四跨膜區(qū)

3、之間，有一個(gè)由43個(gè)氨基酸組成的環(huán)區(qū)(large loop)，構(gòu)成其主要的抗原表位。CD20抗原分子比較容易暴露，易于接近。CD20的生理作用至今尚不清晰，根據(jù)CD20與抗CD20的抗體結(jié)合后B細(xì)胞產(chǎn)生的一系列的生物學(xué)反應(yīng)，推測CD20可能參與B細(xì)胞的增殖、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣離子的跨膜傳遞。
　　 由于Rituximab是一種人鼠嵌合型的抗CD20抗體，在抗體分子中仍然包含約30％的鼠源序列，其在臨床應(yīng)用過程中約17-20％的病

4、人產(chǎn)生了免疫原性，導(dǎo)致無法長期用藥，嚴(yán)重制約了Rituximab的使用，尤其嚴(yán)重影響其在需要長期用藥的自身免疫性疾病適應(yīng)癥治療方面的應(yīng)用。有鑒于此，對(duì)CD20抗體分子進(jìn)行人源化改造，發(fā)現(xiàn)效果更好，免疫原性更低的新抗體分子一直是CD20抗體研究的熱點(diǎn)。
　　 在本課題研究中，采用獨(dú)特的抗體人源化技術(shù)，在鼠單抗2B8（羅氏Rituximab的原始鼠源單抗）的序列基礎(chǔ)之上，設(shè)計(jì)選擇了與MHCⅡ(HLA-DR)結(jié)合位點(diǎn)少的人胚系(ger

5、mline)抗體框架序列進(jìn)行鼠源單抗2B8的人源化改造，大大降低了其免疫原性。同時(shí)，在低免疫源性框架的前提下，通過分子對(duì)接的方法適當(dāng)調(diào)整CDR區(qū)的序列結(jié)構(gòu)，可保持或提高良好的抗原識(shí)別活性和體內(nèi)體外的抗腫瘤活性。
　　 將抗CD20抗體分子充分人源化，篩選得到了新的人源化CD20抗體分了，該抗體分子與Rituximab相比，鼠源序列由30％降低至7％，新抗體分子保留了與美羅華(Rituximab)相同的抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)，即與CD2

6、0的large loop結(jié)合，作用機(jī)制與Rituximab完全一致，體外、體內(nèi)藥效明確，而免疫原性明顯降低，據(jù)此預(yù)期該創(chuàng)新抗體分子不但在腫瘤治療方面與Rituximab有類似的療效和更低的副作用，而且對(duì)多種涉及B細(xì)胞異常激活的自身免疫疾病，也有更廣泛的應(yīng)用前景。
　　 另外，本研究還設(shè)計(jì)了10種制劑處方用于人源化CD20抗體的工藝生產(chǎn)，通過SDS-PAGE和CE-SDS檢測了這10種制劑處方樣品在不同溫度(-80℃，-20℃，4