金柑多糖結(jié)構(gòu)表征及降血脂機(jī)理的研究.pdf

1、金柑(Fortunella margarita(Lour.) Swingle)，也稱金桔、綠桔、金彈桔、金棗，原產(chǎn)于我國(guó)華南地區(qū)，在歐洲、日本、美國(guó)、巴西、澳大利亞、南非和印度等地區(qū)有著廣泛種植。金柑營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，含有人體所需多種維生素、氨基酸以及豐富的多糖、精油、檸檬苦素、黃酮等活性物質(zhì)。本文系統(tǒng)地研究了不同制備方法對(duì)金柑多糖結(jié)構(gòu)特性的影響，金柑多糖流變學(xué)特性、熱穩(wěn)定性及微觀構(gòu)象，金柑多糖分子結(jié)構(gòu)特性，金柑多糖各組分分離純化、結(jié)構(gòu)表征

2、，并結(jié)合各組分體外降血脂構(gòu)效關(guān)系，對(duì)高血脂癥大鼠降血脂機(jī)理進(jìn)行了研究。研究成果為金柑的高值化加工和多糖的開(kāi)發(fā)利用提供了重要的理論依據(jù)，填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外研究空白，豐富了糖科學(xué)的研究?jī)?nèi)涵。
　?。?）不同制備方法對(duì)金柑多糖結(jié)構(gòu)特性的影響
　　本章采用傅里葉紅外光譜（FT-IR）、核磁共振（1H NMR和13C NMR）和凝膠滲透色譜、多角度激光光散射與示差折光檢測(cè)儀（SEC-MALLS-RI）聯(lián)用技術(shù)等對(duì)熱水浸提金柑多糖（WFP）、超

3、聲波輔助提取金柑多糖（UFP）、微波輔助提取金柑多糖（MFP）和超聲波微波協(xié)同萃取金柑多糖（UMFP）的結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行表征。結(jié)果表明，金柑多糖最佳的超聲微波協(xié)同提取工藝條件為：超聲波功率為131W，微波功率為105W，液料比為62mL/g，提取時(shí)間為120s，在此條件下，多糖得率為9.15±0.13％，相比傳統(tǒng)熱水浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法，多糖得率分別提高了405.52%、128.18%和76.64%。FT-IR、1H N

4、MR和13C NMR分析表明，WFP、UFP、MFP和UMFP均為典型的糖類化合物，糖苷鍵類型以β-型糖苷鍵為主，并有少量的α-型糖苷鍵。SEC-MALLS-RI分析表明，WFP和UMFP分子量大部分分布在5.0×106~1.0×107g/mol范圍內(nèi)，分別占其總分子數(shù)量的57.80%和56.84%；UFP和MFP分子量大部分分布在1.0×106~5.0×106 g/mol范圍內(nèi)，分別占其總分子數(shù)量的38.24%和52.39%，這表明超

5、聲波輔助和微波輔助提取法對(duì)金柑多糖分子產(chǎn)生了一定的降解作用，而超聲波微波協(xié)同萃取法對(duì)金柑多糖結(jié)構(gòu)沒(méi)有產(chǎn)生影響。
　?。?）金柑多糖流變學(xué)特性的研究
　　本章對(duì)金柑粗多糖（C-FMPS）和純多糖（P-FMPS）的靜態(tài)流變學(xué)和動(dòng)態(tài)流變學(xué)進(jìn)行對(duì)比研究。靜態(tài)流變學(xué)研究表明，鹽離子的添加使金柑多糖溶液粘度降低，C-FMPS具有很好的酸堿耐受能力，而P-FMPS具有很好的耐酸能力，耐堿能力弱；C-FMPS和P-FMPS溶液體系屬于觸變體

6、系，且P-FMPS溶液的剪切結(jié)構(gòu)恢復(fù)力要低于同濃度的C-FMPS。動(dòng)態(tài)流變學(xué)研究表明，金柑多糖C-FMPS和P-FMPS結(jié)構(gòu)未被破壞的線性粘彈區(qū)分別在8.55%和2.78%應(yīng)變以內(nèi)；在應(yīng)力為2%時(shí)，P-FMPS和C-FMPS溶液的儲(chǔ)能模量G’始終高于損失模量G”，體系以粘性為主，說(shuō)明溶液體系表現(xiàn)為非永久性形變；在溫度20-80℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖溶液的復(fù)合粘度逐漸降低，儲(chǔ)能模量始終高于損耗模量，說(shuō)明溶液體系主要表現(xiàn)為彈性行為，

7、多糖結(jié)構(gòu)未收到破壞；C-FMPS和P-FMPS溶液為剪切變稀的假塑性流體，其流動(dòng)特性符合Power Law模型，且表觀粘度和剪切應(yīng)力隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，濃度越高，溶液偏離牛頓流體越遠(yuǎn)，相同濃度條件下，P-FMPS溶液的表觀粘度和剪切應(yīng)力均大于C-FMPS溶液。
　?。?）金柑多糖熱穩(wěn)定性及微觀構(gòu)象的研究
　　本章采用差式量熱掃描儀（DSC）和動(dòng)態(tài)熱機(jī)械分析儀（DMA）研究C-FMPS和P-FMPS的熱穩(wěn)定性，采用SEC

8、-MALLS-RI測(cè)定其分子量，采用環(huán)境掃描電鏡（SEM）和激光共聚焦掃描顯微鏡（CSLM）觀察其微觀構(gòu)象。結(jié)果表明，P-FMPS氧化分解的溫度要高于C-FMPS，且在氧化分解過(guò)程中P-FMPS釋放出了較高的熱量；在掃描溫度為25-200℃范圍內(nèi)，P-FMPS的儲(chǔ)能模量和損耗模量均高于C-FMPS的儲(chǔ)能模量和損耗模量；P-FMPS儲(chǔ)能模量變化平緩，而C-FMPS儲(chǔ)能模量變化陡峭；P-FMPS損耗模量的峰型寬而平，而C-FMPS損耗模量的

9、峰型窄而高，在高溫條件下，P-FMPS較C-FMPS穩(wěn)定。P-FMPS的分子量分布和相對(duì)分子量均大于C-FMPS。SEM對(duì)多糖粉末的觀察表明，C-FMPS表面粗糙、緊密，無(wú)孔狀結(jié)構(gòu)，而P-FMPS表面較緊密、平整，大量立方孔或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。CSLM對(duì)多糖溶液的觀察表明，C-FMPS分子分散在溶液當(dāng)中，無(wú)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；而P-FMPS分子聚集，有明顯的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這是由于多糖在純化的過(guò)程中多糖分子發(fā)生了重新組合和聚集，導(dǎo)致P-FMPS的分子量增大。C

10、-FMPS和P-FMPS分子量和微觀結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致其流變學(xué)特性和熱穩(wěn)定性的顯著差異。
　?。?）金柑多糖分子結(jié)構(gòu)特性的研究
　　本章采用 SEC-MALLS-RI聯(lián)用技術(shù)系統(tǒng)測(cè)定多糖的分子量、分子量分布、多分散系數(shù)、均方根旋轉(zhuǎn)半徑、半徑分布及其溶液鏈構(gòu)象。金柑多糖重均分子量（Mw）為6.192×106(±0.814%) g/mol，多分散系數(shù)（Mw/Mn）為17.376(±7.974%)，均方根旋轉(zhuǎn)半徑（Rw）為42.1(±

11、9.2%) nm，這表明金柑多糖是一種高度分散的大分子聚合物；分子量分布研究表明：金柑多糖分子量主要分布在1×105-5×106 g/mol范圍內(nèi)，占總分子質(zhì)量的86.48%；峰分布表明：金柑多糖四個(gè)峰（P1、P2、P3和P4）分子分別占總分子質(zhì)量的19.00%、31.60%、31.00%和18.40%，P2和P3組分（達(dá)62.6%）為金柑多糖的主要成分，其分子量分布范圍為1.507×105-1.984×106 g/mol，這表明金柑多

12、糖由四個(gè)不同分子量片段的多糖組成。分子均方根旋轉(zhuǎn)半徑分布表明：金柑多糖分子半徑主要分布在20-50nm范圍內(nèi)，占總分子質(zhì)量的88.79%，且分子質(zhì)量與分子均方根旋轉(zhuǎn)半徑未成正相關(guān)性；在溶液中，金柑多糖為緊密均勻的球形構(gòu)象。以上結(jié)果表明，金柑多糖是一種含有不同分子量片段的雜多糖，這將為進(jìn)一步研究其分離純化、構(gòu)效關(guān)系以及功能活性作用機(jī)理提供理論依據(jù)。
　?。?）金柑多糖分級(jí)純化的研究
　　本章采用DEAE Sepharose C

13、L-6B瓊脂糖凝膠柱線性和梯度洗脫法分級(jí)純化金柑多糖，并采用Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析對(duì)各組分進(jìn)一步分級(jí)純化，采用HPLC色譜法和紫外-可見(jiàn)光譜掃描對(duì)各多糖組分進(jìn)行純度鑒定。結(jié)果表明，線性洗脫法未能將金柑多糖完全分離開(kāi)來(lái)，而采用梯度洗脫法能較好的將金柑多糖各組分分離開(kāi)來(lái)，得到4種不同分子量片段的多糖組分（FMPS1、FMPS2、FMPS3和FMPS4），這與金柑多糖分子結(jié)構(gòu)特性的研究結(jié)果一致。純度鑒定結(jié)果表明，F(xiàn)MPS

14、1、FMPS2、FMPS3和FMPS4均為分子量相對(duì)單一均勻的多糖組分；各多糖組分在260nm和280nm附近無(wú)蛋白質(zhì)和氨基酸的特征吸收峰，這表明四種組分均為純度較高的多糖。
　?。?）金柑多糖各組分結(jié)構(gòu)表征的研究
　　本章采用FT-IR、SEC-MALLS-RI體系、1D NMR和2D NMR等檢測(cè)技術(shù)對(duì)金柑多糖各組分FMPS1、FMPS2、FMPS3和FMPS4的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，F(xiàn)MPS1和FMPS3為果膠

15、類多糖，F(xiàn)MPS1和FMPS2的糖苷鍵類型以α-型糖苷鍵為主，并有少量的β-型糖苷鍵，F(xiàn)MPS3以β-型糖苷鍵為主，并有少量的α-型糖苷鍵，F(xiàn)MPS4以β-型糖苷鍵鏈接而成；各組分的Mw分別為2.572×107 (±0.517%)、1.755×106(±2.009%)、2.563×105(±1.784%)和2.411×105(±1.808%) g/mol，Mw/Mn分別為1.090(±0.708%)、1.220(±2.813%

16、)、1.124(±2.508%)和1.842(±2.509%)，Rw分別為44.6(±0.8%)、33.4(±6.7%)、15.3(±27.5%)和9.4(±69.6%) nm；在溶液中，F(xiàn)MPS1呈現(xiàn)緊密均勻的球形構(gòu)象，F(xiàn)MPS2呈現(xiàn)無(wú)規(guī)則線團(tuán)構(gòu)象，F(xiàn)MPS3和FMPS4為典型的高支化度聚合物；FMPS1主要由α-Glc、α-GalA、β-Rha和β-Galp組成，其初步結(jié)構(gòu)單元為-α-Glc-β-Galp-β-Rha-α-GalA-

17、α-Glc-。FMPS4主要由α-Ara、α-Glc、β-Rha、β-Galp和β-Man組成，其初步結(jié)構(gòu)單元為-α-Ara-β-Rha-β-Galp-α-Glc-β-Man-α-Ara-。
　?。?）金柑多糖各組分體外降血脂作用及其構(gòu)效關(guān)系的研究
　　本章對(duì)金柑多糖各組分胰脂肪酶活性抑制、體外膽酸鹽結(jié)合能力和抗氧化活性進(jìn)行了研究，并將各組分活性與結(jié)構(gòu)進(jìn)行了對(duì)比研究。結(jié)果表明，金柑多糖FMPS1和FMPS3表現(xiàn)出了較強(qiáng)的胰脂

18、肪酶活性抑制作用，這與其單糖組成和相對(duì)分子量有關(guān)；金柑多糖 FMPS1和FMPS2表現(xiàn)出了較強(qiáng)的體外膽酸鹽結(jié)合能力，其結(jié)合能力受到相對(duì)分子量的影響；抗氧化活性表明，F(xiàn)MPS3表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化活性，F(xiàn)MPS4次之，F(xiàn)MPS1和FMPS2的抗氧化活性較弱，金柑多糖的抗氧化活性受其結(jié)構(gòu)特征的影響，如：?jiǎn)翁墙M成、糖苷鍵類型、分子量、分子半徑和溶液鏈構(gòu)象等。金柑多糖各組分降血脂活性并不是由單一脂質(zhì)代謝途徑所決定，而是多途徑綜合影響的結(jié)果。此外

19、，金柑多糖降血脂活性也不是單一結(jié)構(gòu)因素導(dǎo)致的結(jié)果，而是多重結(jié)構(gòu)因素相互作用的結(jié)果。
　　（8）金柑多糖對(duì)高血脂癥大鼠降血脂機(jī)理的研究
　　本章以大鼠為研究對(duì)象，采用高脂飼料誘導(dǎo)大鼠形成動(dòng)物脂代謝紊亂模型，以普通飼料為空白對(duì)照，以辛伐他丁為陽(yáng)性對(duì)照，研究金柑多糖低劑量、中劑量和高劑量對(duì)高血脂癥大鼠血清血脂水平及血漿和組織中抗氧化指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，相對(duì)于高脂模型組，金柑多糖能顯著降低高血脂癥大鼠血清 TG、TC、LDL-C和

20、NEFA含量，顯著提高HDL-C和LIPA含量；金柑多糖可顯著提高高血脂癥大鼠血漿和組織中SOD、GSH-Px和GST活力及T-AOC能力，同時(shí)顯著降低MDA含量，且存在一定的量效關(guān)系；此外，金柑多糖可顯著降低高血脂癥大鼠體重、肝臟和脾臟指數(shù)，且表現(xiàn)出了一定的劑量依賴性。高血脂癥大鼠肝臟和血管病理學(xué)觀察結(jié)果表明，金柑多糖可減少高脂血癥大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積， 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起到了一定的保護(hù)作用。這表明金柑多糖對(duì)高血脂癥大鼠的血脂