代謝工程改造谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)手性2,3-丁二醇及乙偶姻.pdf

1、2,3-丁二醇和乙偶姻作為重要的平臺化合物，在食品、醫(yī)藥、能源和其它行業(yè)具有廣泛應(yīng)用。谷氨酸棒狀桿菌是非致病性的革蘭氏陽性菌，氧氣充足的條件下菌體密度較高，底物消耗快，產(chǎn)物生產(chǎn)率較高。本文從野生型Corynebacterium glutamicumATCC13032和敲除了ldhA、pta、ack基因的菌株SAT7出發(fā)，經(jīng)過代謝工程改造，使谷氨酸棒狀桿菌具有生產(chǎn)兩種手性2,3-丁二醇和乙偶姻的能力。
　　為消除谷棒自身butA基因

2、的影響，重點考察人工引入基因的功效，首先敲除butA得到WT△butA/ SAT7△butA。進而引入B. subtilis168乙偶姻合成途徑alsSD操縱子，得到乙偶姻生產(chǎn)菌株CGF3-10。為生產(chǎn)D-2,3-丁二醇而引入B. Subtilis168的D-2,3-丁二醇脫氫酶編碼基因bdhA，構(gòu)建菌株CGF11-18；為生產(chǎn)meso-2,3-丁二醇而引入K. pneumoniae的meso-2,3-丁二醇脫氫酶編碼基因budC，構(gòu)建

3、菌株CGF19-26。最后，為探究谷棒自身的編碼meso-2,3-丁二醇脫氫酶的基因butA的作用，構(gòu)建過表達載體，得到菌株CGF27-28。
　　利用輔因子工程調(diào)節(jié)菌株胞內(nèi)的氧化還原力。Lactobacillus brevisCICC6239的nox基因，編碼合成的NADH氧化酶使NADH氧化為NAD+，理論上可為細(xì)胞提供乙偶姻合成所需氧化力。E. coliW1485的udhA基因，編碼合成的還原力平衡過程轉(zhuǎn)氫酶可使磷酸戊糖途徑

4、中合成的NADPH轉(zhuǎn)化為NADH，理論上可提高2,3-丁二醇合成所需還原力。
　　通過對工程菌株在不同培養(yǎng)基中的發(fā)酵表征，證明了谷氨酸棒狀桿菌能夠有效合成2,3-丁二醇和乙偶姻。CGF5，在豐富培養(yǎng)基中經(jīng)過50 h時消耗20 g/L葡萄糖，生產(chǎn)了5.94 g/L乙偶姻，達到理論最大得率的60％，具有0.12 g/Lh生產(chǎn)力。CGF18，在基本鹽培養(yǎng)基中經(jīng)過30 h生產(chǎn)了4.65 g/LD-2,3-丁二醇，達到理論最大得率的46%，

5、生產(chǎn)力0.15 g/Lh。CGF28，在添加了0.5%酵母抽提物的基本鹽培養(yǎng)基中經(jīng)過30 h獲得了4.73 g/L的meso-2,3-丁二醇，生產(chǎn)力為0.16 g/Lh，達到理論最大得率的47%。
　　實驗證明，谷氨酸棒狀桿菌具備良好的2,3-丁二醇和乙偶姻合成能力。編碼合成D-2,3-丁二醇脫氫酶的外源基因bdhA在谷氨酸棒狀桿菌表達效果良好。而編碼合成meso-2,3-丁二醇脫氫酶的外源基因budC，表達效果不如谷棒本身具有的