13409.谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)琥珀酸的代謝工程改造

1、谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)琥珀酸的代謝工程改造谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)琥珀酸的代謝工程改造MetabolicengineeringofCynebacteriumglutamicumfhighlevelproductionofsuccinate（國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目資助2011CBA008042012CB725203）（國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助NSFC21176182）一級(jí)學(xué)科：化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)科專業(yè)：生物化工研究生：朱年青指導(dǎo)教師：趙學(xué)明教授天津大學(xué)化工學(xué)

2、院2013年6月中文摘要中文摘要本文圍繞琥珀酸的生物合成，以野生型谷氨酸棒桿菌CynebacteriumglutamicumATCC13032為出發(fā)菌株進(jìn)行系統(tǒng)代謝工程改造，構(gòu)建了一系列能夠在厭氧和好氧條件下高效生產(chǎn)琥珀酸的突變株。通過(guò)中心碳代謝的比較分析和單基因敲除分析對(duì)琥珀酸厭氧合成的途徑進(jìn)行了鑒定。采用干實(shí)驗(yàn)基元模式分析和濕實(shí)驗(yàn)代謝通量分析相結(jié)合的方式鑒定出基因靶點(diǎn)并進(jìn)行改造，通過(guò)發(fā)酵和通量分析驗(yàn)證靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。利用兩階段高密

3、度發(fā)酵的方式來(lái)提高琥珀酸的濃度。另一方面，通過(guò)引入枯草芽孢桿菌的乙酸利用途徑減少好氧條件下乙酸的積累。同時(shí)過(guò)表達(dá)檸檬酸合酶減少丙酮酸的積累，增加TCA循環(huán)的通量。最后，通過(guò)分批補(bǔ)料的培養(yǎng)方式評(píng)價(jià)好氧生產(chǎn)琥珀酸的可行性。得到的主要結(jié)果如下：對(duì)C.glutamicumATCC13032進(jìn)行了厭氧生產(chǎn)琥珀酸的途徑鑒定。比較C.glutamicumATCC13032和自然界中分離的琥珀酸生產(chǎn)菌株的中心代謝途徑，通過(guò)理性分析得到潛在的影響琥珀酸合

4、成的基因靶點(diǎn)。通過(guò)單基因敲除和厭氧發(fā)酵，證明了野生型C.glutamicumATCC13032在厭氧條件下利用TCA還原臂合成琥珀酸。采用組合敲除策略，敲除乳酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、丙酮酸氧化還原酶和乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶后，突變株C.glutamicumSAZ1的乙酸產(chǎn)量顯著降低，琥珀酸得率為0.99mol(molglucose)1?；诨蚪M尺度規(guī)模的谷氨酸棒桿菌模型，構(gòu)建了一個(gè)精簡(jiǎn)的中心碳代謝網(wǎng)絡(luò)模型，通過(guò)基元模式分析和突變株

5、C.glutamicumSAZ1的代謝通量分析，鑒定出三個(gè)基因靶點(diǎn)：回補(bǔ)反應(yīng)、乙醛酸循環(huán)和檸檬酸合酶。根據(jù)預(yù)測(cè)依次改造并發(fā)酵驗(yàn)證。進(jìn)一步過(guò)表達(dá)琥珀酸輸出蛋白得到突變株C.glutamicumSAZ2（pEpycgltAsucE，pXaceAB），琥珀酸得率為1.43mol(molglucose)1。它的通量分布與最佳通量分布更為接近。通過(guò)胞內(nèi)代謝物測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)是由于胞內(nèi)的琥珀酸含量下降，從而減輕了對(duì)乙醛酸循環(huán)的抑制作用。采用高密度厭氧

6、發(fā)酵，琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到930mM（110gL1），得率為1.32mol(molglucose)1，生產(chǎn)率為9.48mMh1。失活琥珀酸脫氫酶復(fù)合體、乙酸和乳酸生成途徑，過(guò)表達(dá)丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，引入來(lái)自于枯草芽孢桿菌的乙酸利用途徑，過(guò)表達(dá)自身的檸檬酸合酶后，突變株C.glutamicumZX1(pEacsAgltA)在好氧條件下的琥珀酸得率為0.61mol(molglucose)1。在分批補(bǔ)料好氧培養(yǎng)過(guò)程中，琥珀酸濃度達(dá)