代謝工程方法改造谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)乙偶姻.pdf

1、乙偶姻作為一種重要的平臺(tái)化合物,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和其它行業(yè)。谷氨酸棒狀桿菌是安全的革蘭氏陽性菌,好氧培養(yǎng)時(shí)菌體密度較高,底物消耗速率快,可以獲得較理想的產(chǎn)物生產(chǎn)率。本文圍繞乙偶姻生物合成反應(yīng),以CorynebacteriumglutamicumATCC13032為出發(fā)菌株進(jìn)行代謝工程改造,旨在利用代謝工程方法改造谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)乙偶姻,并提高其產(chǎn)量和得率。
　　首先在C.glutamicumATCC13032中表達(dá)Bacil

2、lussubtilis168乙偶姻合成關(guān)鍵基因alsSD操縱子,得到乙偶姻生產(chǎn)菌株;進(jìn)而敲除丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E1亞基基因和乳酸脫氫酶基因,敲除2,3-丁二醇脫氫酶基因(butA),提高乙偶姻得率;進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)速對(duì)菌株CGL4乙偶姻生產(chǎn)的影響;最后利用豐富培養(yǎng)基對(duì)菌株CGL4發(fā)酵培養(yǎng),提高乙偶姻生產(chǎn)力。
　　在谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pEC-XK99E上插入來自于B.subtilis168生產(chǎn)乙偶姻的alsSD操縱子,得到

3、乙偶姻表達(dá)質(zhì)粒pEC-XK99E-alsSD。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化C.glutamicumATCC13032得到菌株CGL1。野生型菌株和工程菌株CGL1的乙酰乳酸合成酶ALS酶活測(cè)定結(jié)果顯示,與野生型菌株相比CGL1乙酰乳酸合成酶比酶活提高了17倍,同時(shí)CGL1生產(chǎn)了2.14g/L乙偶姻。
　　為了提高乙偶姻的產(chǎn)率,增加合成乙偶姻的前體物質(zhì)丙酮酸的供給,減少副產(chǎn)物乳酸的生成,通過蔗糖負(fù)篩選無痕敲除方法敲除aceE和ldhA基因,得到雙基因

4、敲除菌株CGL2。與CGL1相比乙偶姻的產(chǎn)量提高到5.09g/L,發(fā)酵產(chǎn)物未檢測(cè)到乳酸,有微量的2,3-丁二醇。進(jìn)一步阻斷乙偶姻消耗途徑,敲除CGL2潛在的2,3-丁二醇脫氫酶基因butA。發(fā)酵結(jié)果顯示,失活butA基因可以完全阻斷2,3-丁二醇的生成途徑,乙偶姻產(chǎn)量提高到5.88g/L。
　　代謝工程改造菌株CGL4在發(fā)酵過程中檢測(cè)到有副產(chǎn)物琥珀酸的積累,為了進(jìn)一步提高乙偶姻的產(chǎn)量,減少副產(chǎn)物琥珀酸的生成,考察了轉(zhuǎn)速對(duì)菌株發(fā)酵生