重構(gòu)樹(shù)干畢赤酵母合成菌株利用木糖生產(chǎn)富馬酸.pdf

1、富馬酸是一種重要的四碳二羧酸平臺(tái)化合物，被美國(guó)能源部列為二十一世紀(jì)優(yōu)先發(fā)展的12種平臺(tái)化合物之一，廣泛用于化工、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域中。根霉屬菌株是富馬酸的主要生產(chǎn)者，然而由于其具有復(fù)雜的生長(zhǎng)形態(tài)，較低的特異性重組頻率，以及缺少有效的基因操作工具，利用基因工程手段對(duì)其進(jìn)行改造仍很困難，從而限制了富馬酸產(chǎn)量的提高。木質(zhì)纖維素是自然界最豐富的可再生資源，木糖是木質(zhì)纖維素的重要組成部分，是繼葡萄糖之后自然界最豐富的糖類(lèi)，有效利用木糖是木質(zhì)纖維素開(kāi)

2、發(fā)利用的關(guān)鍵。
　　本文首次通過(guò)合成生物學(xué)的方法，以具有優(yōu)秀木糖代謝能力的樹(shù)干畢赤酵母（Scheffersomyces stipitis）為宿主，異源表達(dá)來(lái)自米根霉的富馬酸還原合成途徑，包括丙酮酸羧化酶（RoPYC）、蘋(píng)果酸脫氫酶（RoMDH）和富馬酸酶（RoFUM1），構(gòu)建了S. stipitis富馬酸初始合成菌株P(guān)SRPMF。在微氧條件下，以50 g/L木糖為底物，經(jīng)過(guò)96 h發(fā)酵，富馬酸產(chǎn)量達(dá)到1.86 g/L。
　　

3、為了提高富馬酸產(chǎn)量，本文對(duì)富馬酸初始合成菌株的發(fā)酵行為進(jìn)行理性分析，發(fā)現(xiàn)其在富馬酸生產(chǎn)過(guò)程中的主要障礙，并依次對(duì)富馬酸合成途徑活性、碳代謝流分配和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑三個(gè)關(guān)鍵過(guò)程進(jìn)行了理性?xún)?yōu)化。首先根據(jù)樹(shù)干畢赤酵母的密碼子偏好性，將來(lái)自米根霉的富馬酸合成途徑進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使丙酮酸羧化酶、蘋(píng)果酸脫氫酶和富馬酸酶活性分別提高了28.12％、17.35%和16.13%，相對(duì)表達(dá)量分別提高了35.39%、20.29%和18.75%，富馬酸產(chǎn)量達(dá)到2.65

4、g/L；其次，通過(guò)敲除自身富馬酸酶(Psfum1和Psfum2)，調(diào)節(jié)碳代謝流分配，減少富馬酸消耗，使富馬酸產(chǎn)量提高至3.21 g/L；再次，為了進(jìn)一步促進(jìn)胞內(nèi)富馬酸轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，構(gòu)建了異源高效富馬酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑Y(jié)MAE1(來(lái)自栗酒裂殖酵母SpMAE1)，提高了富馬酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力，使胞內(nèi)富馬酸含量降低了43.75%，達(dá)到0.36 mg/g DCW，促進(jìn)了富馬酸合成；最終獲得了能夠利用木糖高效生產(chǎn)富馬酸的樹(shù)干畢赤酵母合成菌株P(guān)SYPMFfS，在微氧