重構樹干畢赤酵母合成菌株利用木糖生產富馬酸.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、富馬酸是一種重要的四碳二羧酸平臺化合物,被美國能源部列為二十一世紀優(yōu)先發(fā)展的12種平臺化合物之一,廣泛用于化工、醫(yī)藥和食品等領域中。根霉屬菌株是富馬酸的主要生產者,然而由于其具有復雜的生長形態(tài),較低的特異性重組頻率,以及缺少有效的基因操作工具,利用基因工程手段對其進行改造仍很困難,從而限制了富馬酸產量的提高。木質纖維素是自然界最豐富的可再生資源,木糖是木質纖維素的重要組成部分,是繼葡萄糖之后自然界最豐富的糖類,有效利用木糖是木質纖維素開

2、發(fā)利用的關鍵。
  本文首次通過合成生物學的方法,以具有優(yōu)秀木糖代謝能力的樹干畢赤酵母(Scheffersomyces stipitis)為宿主,異源表達來自米根霉的富馬酸還原合成途徑,包括丙酮酸羧化酶(RoPYC)、蘋果酸脫氫酶(RoMDH)和富馬酸酶(RoFUM1),構建了S. stipitis富馬酸初始合成菌株PSRPMF。在微氧條件下,以50 g/L木糖為底物,經過96 h發(fā)酵,富馬酸產量達到1.86 g/L。
  

3、為了提高富馬酸產量,本文對富馬酸初始合成菌株的發(fā)酵行為進行理性分析,發(fā)現(xiàn)其在富馬酸生產過程中的主要障礙,并依次對富馬酸合成途徑活性、碳代謝流分配和轉運途徑三個關鍵過程進行了理性優(yōu)化。首先根據(jù)樹干畢赤酵母的密碼子偏好性,將來自米根霉的富馬酸合成途徑進行密碼子優(yōu)化,使丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶和富馬酸酶活性分別提高了28.12%、17.35%和16.13%,相對表達量分別提高了35.39%、20.29%和18.75%,富馬酸產量達到2.65

4、g/L;其次,通過敲除自身富馬酸酶(Psfum1和Psfum2),調節(jié)碳代謝流分配,減少富馬酸消耗,使富馬酸產量提高至3.21 g/L;再次,為了進一步促進胞內富馬酸轉運至胞外,構建了異源高效富馬酸轉運途徑YMAE1(來自栗酒裂殖酵母SpMAE1),提高了富馬酸轉運能力,使胞內富馬酸含量降低了43.75%,達到0.36 mg/g DCW,促進了富馬酸合成;最終獲得了能夠利用木糖高效生產富馬酸的樹干畢赤酵母合成菌株PSYPMFfS,在微氧

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