畢赤酵母生產(chǎn)重組蛋白A工藝研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal Protein A，SPA）是金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁蛋白，具有與免疫球蛋白特異性結(jié)合的能力。SPA被廣泛的應(yīng)用于抗體分離純化、免疫檢測(cè)和診斷等方面，市場(chǎng)需求量巨大。目前所應(yīng)用的SPA多是以大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組蛋白A(rSPA)。此種生產(chǎn)技術(shù)中rSPA為大腸桿菌的胞內(nèi)蛋白，發(fā)酵密度不高，后續(xù)純化分離工藝步驟繁瑣復(fù)雜，產(chǎn)品得率低，生產(chǎn)成本高。為此，本論文嘗試以含SPA基因的重組畢赤

2、酵母rGS115-spa為表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)其分泌表達(dá)的高密度發(fā)酵和后續(xù)純化工藝進(jìn)行深入研究，嘗試建立了一套新的rSPA大規(guī)模生產(chǎn)工藝。
　　首先，本論文通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)探索rGS115-spa在搖瓶中的蛋白表達(dá)情況，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)溫度、pH、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件的優(yōu)化，確定相對(duì)較優(yōu)的表達(dá)條件，為后續(xù)高密度發(fā)酵實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　其次，在前期搖瓶實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)5L發(fā)酵罐中rSPA的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括誘導(dǎo)起始時(shí)菌體密度、誘導(dǎo)溫度、

3、pH和誘導(dǎo)時(shí)間等，最終確定在菌體密度達(dá)到OD600為300-350時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)，溫度22℃，誘導(dǎo)pH為3.0，經(jīng)68 h的誘導(dǎo)后，rSPA產(chǎn)量可達(dá)8.8g/L，占發(fā)酵液中總蛋白的80％以上，較大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)有明顯提高。
　　然后，利用發(fā)酵所得含rSPA發(fā)酵上清液，進(jìn)行其分離純化工藝的研究。利用畢赤酵母生產(chǎn)的rSPA是分泌型蛋白，可以省去細(xì)胞破碎、DNA沉淀等前處理步驟，但發(fā)酵液中色素及降解片段的去除是rSPA分離純化工藝的難點(diǎn)。由

4、于色素類物質(zhì)可吸附到大部分層析介質(zhì)上，影響層析柱使用效果，本論文嘗試?yán)昧蛩徜@沉淀或乙醇沉淀偶聯(lián)活性炭吸附和除鹽柱過(guò)濾等手段去除色素。綜合色素去除效果、蛋白回收率以及操作簡(jiǎn)便性等因素考慮，最終選用除鹽柱進(jìn)行色素去除。去除大部分色素后的rSPA溶液被置換為25 mM，pH8.0的Tis-HCl緩沖液，經(jīng)過(guò)DEAE離子交換層析純化后去除了原發(fā)酵液中降解產(chǎn)物，洗脫液rSPA純度可達(dá)色譜純標(biāo)準(zhǔn)，回收率高達(dá)79.4％。
　　最后，本論文利用