樹(shù)干畢赤酵母cDNA文庫(kù)構(gòu)建及EST序列測(cè)定.pdf

1、　　將植物纖維水解液中30﹪左右的木糖有效利用轉(zhuǎn)化為酒精是降低酒精生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。樹(shù)干畢赤酵母是研究得最多、最具工業(yè)應(yīng)用前景的木糖發(fā)酵酵母，目前對(duì)于樹(shù)干畢赤酵母木糖代謝的生理學(xué)機(jī)制還知之甚少。 　　以cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)的EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)技術(shù)是一種快速的進(jìn)行基因功能分析及發(fā)現(xiàn)新基因的有效方法。本論文構(gòu)建了樹(shù)干畢赤酵母P5776的cDNA文庫(kù)，并以該文庫(kù)為材料進(jìn)行了大規(guī)模的5’端EST序列測(cè)定，為酵母的基因功能分析、木糖代謝途徑研究

2、以及篩選有關(guān)性狀基因提供了基礎(chǔ)工具。 　　以具有不同生長(zhǎng)速率的樹(shù)干畢赤酵母為材料提取RNA，發(fā)現(xiàn)處于對(duì)數(shù)中期的酵母細(xì)胞易于提取出總RNA；分別以勻漿法、玻砂法、液氮研磨法以及液氮速凍加液氮研磨的方法破碎細(xì)胞，再分別以TRIZOL(苯酚和異硫酸氰胍的均一混合物)和變性裂解液(主要成分是β-巰基乙醇和異硫酸氰胍)為試劑在溶解P5776細(xì)胞組分的同時(shí)保持其中RNA的完整性，通過(guò)苯酚和氯仿多次抽提除凈雜蛋白，以異丙醇沉淀回收特異的保留在水層中

3、的RNA，最后經(jīng)乙醇洗滌得到備用RNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用變性裂解液，采取液氮速凍加液氮研磨的方法提取酵母細(xì)胞RNA，效果良好。本論文以約900mg(干重)酵母為材料提取獲得了約1.2mg總RNA，提取得率達(dá)到1.3‰，提取出的RNA具備完整性，質(zhì)量高，是cDNA文庫(kù)構(gòu)建的良好材料。 　　以提取出的RNA為材料，純化出mRNA(信使RNA)，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈，以置換合成法合成cDNA雙鏈，通過(guò)膠純化回收的方法篩選出其中大于