強直性脊柱炎TCR二次重排及BV CDR3譜型和分子特征初步研究.pdf

1、目的：
　　通過分析對AS患者外周血CD4+、CD8+T細胞TCR BV CDR3譜型多樣性特點及檢測TCR二次重排的相關基因，探討TCR CDR3氨基酸序列和TCR二次重排與AS發(fā)病的相關性，為AS中T細胞致病機制的研究和個性化治療提供一條新的途徑。
　　方法：
　?。?）免疫磁珠法分離AS患者與健康對照組外周血中的CD4+、CD8+淋巴細胞。
　　（2）提取各樣本總RNA并按RT-PCR Kit操作說明書逆轉

2、錄合成cDNA。
　?。?）參照文獻設計并合成TCR BV亞家族及實驗對照引物，RT-PCR法擴增各樣本TCR亞家族，并用2％瓊脂凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。
　?。?）免疫掃描技術分析PCR產(chǎn)物，并用將單/寡克隆基因進行測序，分析AS患者CD4+、CD8+TCR BV家族CDR3區(qū)譜系多態(tài)性及克隆性的特點
　　（5）RT-PCR法檢測各樣本RAG1、RAG2、TdT、Ku70、Ku80表達情況，同時檢測TCR重排過程中間

3、產(chǎn)物BD2-BJ2重排刪除環(huán)。
　　結果：
　?。?）健康對照組及AS患者CD4+、CD8+TCR BV各家族PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，各家族均有表達。正常健康人CD4+、CD8+TCR BV亞家族免疫掃描均呈正態(tài)分布。
　　（2）12例AS患者CD4+TCR BV家族絕大多數(shù)呈現(xiàn)與健康對照相似的正態(tài)分布的鐘型峰圖，僅少數(shù)家族呈不規(guī)則異常峰型或偏峰，極少家族出現(xiàn)寡克隆趨勢，僅2例患者各出現(xiàn)1個單克隆家族單峰

4、。不同患者的CD4+TCR BV家族異常峰型率在4%（1/26）～27%(7/26)，異常率出現(xiàn)較高的家族有BV2和BV3均為75％(9/12），BV19為50%(6/12)，異常率較低的家族為BV9和BV13.2均為8.3%（1/12）。
　?。?）12例AS患者CD8+TCR BV家族大多數(shù)呈現(xiàn)非正態(tài)異常峰型，其中7例患者CD8+TCR BV家族異常分型率高于50%以上，明顯多于CD4+T細胞。AS患者CD8+TCR BV26

5、個亞家族均出現(xiàn)異常峰率，其中異常率較高的家族為BV3和BV19均為83％(10/12），異常率較低的家族為BV8為17%（2/12）。
　?。?）同一患者出現(xiàn)不同BV亞家族單克隆增生，其TCR BV CDR3區(qū)長度和序列有所不同。同一BV亞家族在不同患者其CDR3區(qū)長度和序列也不相同。顯示同時存在一些共同基序。
　　(5）6例AS患者治療前后CD8+TCR BV亞家族異常率均高于治療前后CD4+T細胞，其中3例患者治療后CD

6、4+TCR BV亞家族異常率下降，4例患者CD8+TCR BV亞家族異常率均下降。
　　(6）20例健康對照、病例對照組及AS患者RAG1、RAG2、TdT、Ku70、Ku80 PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳圖顯示， AS患者、正常健康對照組均表達Ku70；8例AS患者、3例正常健康檢測到Ku80的特異性條帶。其他條帶未檢測出。
　?。?）16例正常對照檢出BD1-BJl sjTRECs S1，AS患者均未檢出sjTRECs