脂肪酶及其固定化技術(shù)在典型無環(huán)單萜類乙酸酯香料制備中的應(yīng)用研究.pdf

1、無環(huán)單萜類乙酸酯作為自然香精和香料的重要組成成分，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、飲料、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)，具有巨大的應(yīng)用價值。針對天然提取法的高成本和化學(xué)合成法的高污染、副產(chǎn)物多等問題，本論文利用非水相中的脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)分別制備乙酸香茅酯和乙酸香葉酯兩種典型的無環(huán)單萜類乙酸酯。其主要內(nèi)容如下:
　　(1)乙酸香茅酯的制備及其動力學(xué)研究:首先對實驗室現(xiàn)有的6種不同來源的游離脂肪酶進(jìn)行篩選，確定1號脂肪酶為該反應(yīng)的最佳實驗用酶。進(jìn)一步對反

2、應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明:以乙酸乙烯酯作為反應(yīng)物兼溶劑時反應(yīng)速度最快;反應(yīng)溫度為40℃;搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到200rpm后外擴散基本可以消除;酶量為9mg/mL;在此優(yōu)化條件下，反應(yīng)5h產(chǎn)率可達(dá)99％以上。底物濃度在500mmol/L以下時，未發(fā)現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，而實驗結(jié)果顯示產(chǎn)物抑制的影響不可忽略。對該脂肪酶的重復(fù)利用性的研究顯示，第2次重復(fù)使用該脂肪酶時，產(chǎn)率就降為原來的55.57％，這表明該脂肪酶的穩(wěn)定性還有待提高。在此基礎(chǔ)上，對該無溶劑體

3、系中脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)合成乙酸香茅酯的反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示該反應(yīng)為一個存在產(chǎn)物抑制的乒乓雙-雙反應(yīng)機制。其反應(yīng)速度方程如下:
　　V=Vm[B]/KA+KB+KQA(1+[Q]KIQ)[Q]+KBQA[B][Q]利用Matlab擬合出模型參數(shù)分別為:
　　Vm=0.4563mmol/L/min KA=1.408×103mmol/L KB=0.5336
　　KQA=2.318×10-3 KBQA=2.038×

4、10-2L/mmol KIQ=5.001×102mmol/L將該模型參數(shù)代入反應(yīng)速度方程，計算出模型的相對誤差為11.98％，擬合值和實驗值能較好的吻合。
　　(2)乙酸香葉酯的制備及其動力學(xué)研究:對實驗室現(xiàn)有的6種不同來源的游離脂肪酶進(jìn)行篩選，得到1號脂肪酶為該反應(yīng)的最佳實驗用酶。確定該反應(yīng)的優(yōu)化反應(yīng)條件為:以乙酸乙烯酯作為反應(yīng)物兼溶劑;反應(yīng)溫度為30℃;搖床轉(zhuǎn)速為240rpm;反應(yīng)酶量為12mg/mL;優(yōu)化反應(yīng)條件下，反應(yīng)3h

5、產(chǎn)率可達(dá)99％左右。底物濃度在500mmol/L以下時，不存在底物抑制現(xiàn)象，同時也不存在產(chǎn)物抑制。該脂肪酶重復(fù)使用8次后，反應(yīng)的產(chǎn)率僅剩原來的42％，這表明所用脂肪酶的穩(wěn)定性也還有待提高。動力學(xué)研究表明該反應(yīng)為一個無底物、無產(chǎn)物抑制的乒乓雙-雙反應(yīng)機制，其反應(yīng)速度方程如下:
　　V=Vm[B]/KA+KB[B]+ KQA[Q]+ KBQA[B][Q]擬合得到的模型參數(shù)分別為:
　　Vm=0.1154mmol/L/min KA

6、=1.886×102mmol/L KB=0.7842
　　KQA=0.1335 KBQA=1.400×10-3L/mmol計算出模型的相對誤差為1.88％，擬合值和實驗值能較好的吻合。
　　(3)脂肪酶的固定化:以鄰苯二胺作為單體制備聚鄰苯二胺空心微球，利用五種不同的硅烷試劑對該聚合物表面進(jìn)行修飾，并采用吸附法對1號脂肪酶進(jìn)行固定化，考察固定化條件和固定化酶催化性能，結(jié)果顯示:經(jīng)硅烷改性的聚鄰苯二胺能明顯影響固定化酶的蛋白結(jié)

7、合量以及酶活，其中N-辛基三甲氧基硅烷改性的載體用于固定化脂肪酶的效果最佳。對固定化工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終確定吸附固定化脂肪酶的優(yōu)化條件為:硅烷用量為8mL，酶與載體的比例為1/30，緩沖液為pH8.0，40mmol/L的磷酸緩沖液，吸附時間為5h，吸附溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。該條件下制備的固定化脂肪酶的水解比活和轉(zhuǎn)酯比活分別為游離酶的11.8和12.6倍。此外，經(jīng)固定化后該脂肪酶的熱穩(wěn)定性和存儲穩(wěn)定性也均有了明顯的提高。

8、r>　　(4)固定化脂肪酶在典型無環(huán)單萜類乙酸酯制備中的應(yīng)用:將所制固定化脂肪酶分別用于催化合成乙酸香茅酯和乙酸香葉酯兩個反應(yīng)體系中，對反應(yīng)工藝進(jìn)行優(yōu)化。最終確定兩個反應(yīng)的優(yōu)化條件均為:固定化酶的用量為0.4g，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)過程中搖床轉(zhuǎn)速為200rpm;在此條件下，反應(yīng)1.5h后乙酸香茅酯和乙酸香葉酯的產(chǎn)率均可達(dá)99％以上。對固定化脂肪酶重復(fù)利用性的研究表明:在乙酸香茅酯的制備反應(yīng)體系中，第2次重復(fù)使用該固定化脂肪酶時，殘余酶