赭曲霉毒素A模擬表位二級(jí)庫(kù)的構(gòu)建及其全抗原的生物合成.pdf

1、赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是一種由真菌代謝產(chǎn)生的有毒化合物。OTA通過受污染的食物和飼料進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi),導(dǎo)致急性或慢性中毒。為了降低OTA對(duì)人類和動(dòng)物的危害風(fēng)險(xiǎn),國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)發(fā)展出眾多類型的檢測(cè)方法。其中以簡(jiǎn)單、快速、高特異性的免疫分析法應(yīng)用最為廣泛。
　　然而,在免疫學(xué)檢測(cè)過程中使用的真菌毒素可能危害檢測(cè)人員的身體健康。而且,價(jià)格昂貴的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品也在一定程度上限制了免疫學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用。此外,真菌

2、毒素全抗原的人工合成方法存在批間差異大的缺陷。因此,人們?cè)噲D開發(fā)一些能夠代替人工抗原的檢測(cè)材料,而模擬表位正是其中一種。
　　模擬表位能夠模擬抗原表位與抗體之間的相互作用,主要來源于噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)。但是從隨機(jī)肽庫(kù)中淘選獲得的模擬表位受到原始肽庫(kù)多樣性的限制,不一定能達(dá)到建立高靈敏度檢測(cè)方法的要求。因此本研究通過構(gòu)建噬菌體展示二級(jí)肽庫(kù),對(duì)原始的OTA模擬表位進(jìn)行體外進(jìn)化,再以此建立OTA的免疫檢測(cè)方法,達(dá)到提高靈敏度之目的。最后

3、,再利用基因工程技術(shù)以及蛋白質(zhì)工程技術(shù),實(shí)現(xiàn)OTA全抗原的生物合成,并以其建立免疫學(xué)檢測(cè)方法。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果概括如下:
　　1、OTA噬菌體展示模擬表位的淘選
　　為獲得OTA的模擬表位,首先以抗OTA單克隆抗體為靶分子,在商業(yè)噬菌體展示十二肽庫(kù)和環(huán)七肽庫(kù)中進(jìn)行淘選。經(jīng)過三輪親和淘選以及ELISA鑒定,獲得7個(gè)展示OTA模擬表位的噬菌體。通過比對(duì)這些模擬表位的多肽序列,發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)模擬表位含有FQLH序列,因此推斷FQL

4、H可能為OTA模擬表位的保守序列,并且以此應(yīng)用于噬菌體展示二級(jí)肽庫(kù)的構(gòu)建。
　　2、噬菌體展示二級(jí)肽庫(kù)的構(gòu)建與篩選
　　將保守序列 FQLH固定于模擬表位的中間位置,在其兩端分別引入3個(gè)隨機(jī)的氨基酸殘基,構(gòu)建噬菌體展示二級(jí)肽庫(kù)。該噬菌體展示肽庫(kù)的庫(kù)容量為1.2×108 pfu,理論上包含了所有可能存在的氨基酸序列(6.4×107)。通過嚴(yán)格控制淘選條件,能夠改善噬菌體展示模擬表位與抗OTA單克隆抗體的結(jié)合性能。經(jīng)ELISA鑒

5、定,噬菌體展示 OTA模擬表位的半抑制濃度( half inhibition concentration, IC50)值從原來的0.50-1.03 ng/mL降低至0.052-0.336 ng/mL。
　　3、基于OTA噬菌體模擬表位免疫分析方法的建立
　　以噬菌體展示的OTA模擬表位取代人工抗原,建立化學(xué)發(fā)光ELISA和膜基質(zhì)免疫分析法。化學(xué)發(fā)光ELISA的IC50為0.04 ng/mL,線性范圍為0.006-0.245

6、ng/mL;膜基質(zhì)免疫分析法的閾值設(shè)定為1 ng/mL。分別采用這兩種方法檢測(cè)40份食品及飼料樣品,并將測(cè)定數(shù)據(jù)與商業(yè)ELISA試劑盒進(jìn)行比較,結(jié)果顯示三者的相關(guān)性良好。
　　4、OTA全抗原的生物合成及其在免疫分析中的應(yīng)用
　　將OTA模擬表位的編碼基因克隆至pMAL-pIII表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá),獲得OTA模擬表位與 MBP蛋白融合表達(dá)的產(chǎn)物,即生物合成抗原,并將其應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光ELISA和膜基質(zhì)免疫分析法?；?/p>