抗赭曲霉毒素A納米抗體二價(jià)及多價(jià)表達(dá).pdf

1、赭曲霉毒素（Ochratoxin）是某些曲霉及青霉屬的菌種在某些特定條件下代謝產(chǎn)生的分子結(jié)構(gòu)類似的一組化合物，包括7種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中以赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）毒性最強(qiáng)，分布最廣，對(duì)人類和動(dòng)物影響最大。OTA主要污染谷物、玉米、花生、棉籽、堅(jiān)果、咖啡豆、水果等多種農(nóng)產(chǎn)品。OTA主要具有腎毒性、肝毒性、免疫抑制等毒性作用。目前OTA的主要檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法、薄層層析色譜法，

2、酶聯(lián)免疫吸附法等國(guó)標(biāo)規(guī)定的檢測(cè)方法，以及膠體金免疫層析等快速篩查的方法。納米抗體（Nanobody,Nb），通過克隆駝源動(dòng)物體內(nèi)天然存在的重鏈抗體可變區(qū)獲得，是目前已知最小的抗原結(jié)合單位。納米抗體具有良好的熱穩(wěn)定性及水溶性，可以通過多種表達(dá)體系順利表達(dá)等特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域及食品安全領(lǐng)域有較廣泛的應(yīng)用前景?？捎糜谛》肿佣嗑刍慕Y(jié)構(gòu)較多，本研究采用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferases,GSTs）及霍亂毒

3、素B亞基（Cholera toxin B subunit,CTB）分別構(gòu)建二價(jià)抗OTA納米抗體GST-VHH及五價(jià)抗OTA納米抗體CTB-VHH，并建立基于CTB-VHH的OTA的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，主要研究結(jié)果如下：
　　1．二價(jià)及五價(jià)納米抗體的原核表達(dá)及活性分析
　　成功構(gòu)建二價(jià)納米抗體GST-VHH及五價(jià)納米抗體CTB-VHH表達(dá)菌株，并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)純化后得到純度較高的GST-VHH及CTB-VHH。通過

4、SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，GST-VHH主要以單體形式存在，CTB-VHH主要以五聚體形式存在。經(jīng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定得到GST-VHH、CTB-VHH的IC50分別為2.11 ng/mL、0.65 ng/mL。通過不同溫度梯度下孵育一段時(shí)間后進(jìn)行ELISA測(cè)定GST-VHH及CTB-VHH的熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明GST-VHH于50.21℃下孵育5 min后失去一半活性，CTB-VHH于65.64℃下孵育5 min后失去一半活性，二者耐

5、熱性較VHH單體均有一定程度下降。
　　2．五價(jià)納米抗體CTB-VHH的應(yīng)用研究
　　建立了基于CTB-VHH的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，IC500.65 ng/mL，線性范圍0.27~1.58 ng/mL，LOD0.095 ng/mL。本研究建立的檢測(cè)方法與其他真菌毒素?zé)o明顯交叉反應(yīng)，批內(nèi)加標(biāo)回收率80.0~108.4％，批內(nèi)變異系數(shù)2.51~7.48%，批間加標(biāo)回收率84.7~99.6%，批間變異系數(shù)2.61~4.79