抗赭曲霉毒素A納米抗體二價及多價表達.pdf

1、赭曲霉毒素（Ochratoxin）是某些曲霉及青霉屬的菌種在某些特定條件下代謝產(chǎn)生的分子結構類似的一組化合物，包括7種結構類似的化合物，其中以赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）毒性最強，分布最廣，對人類和動物影響最大。OTA主要污染谷物、玉米、花生、棉籽、堅果、咖啡豆、水果等多種農(nóng)產(chǎn)品。OTA主要具有腎毒性、肝毒性、免疫抑制等毒性作用。目前OTA的主要檢測方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜串聯(lián)法、薄層層析色譜法，

2、酶聯(lián)免疫吸附法等國標規(guī)定的檢測方法，以及膠體金免疫層析等快速篩查的方法。納米抗體（Nanobody,Nb），通過克隆駝源動物體內(nèi)天然存在的重鏈抗體可變區(qū)獲得，是目前已知最小的抗原結合單位。納米抗體具有良好的熱穩(wěn)定性及水溶性，可以通過多種表達體系順利表達等特點，在醫(yī)學診斷領域及食品安全領域有較廣泛的應用前景。可用于小分子多聚化的結構較多，本研究采用谷胱甘肽S-轉移酶（Glutathione S-transferases,GSTs）及霍亂毒

3、素B亞基（Cholera toxin B subunit,CTB）分別構建二價抗OTA納米抗體GST-VHH及五價抗OTA納米抗體CTB-VHH，并建立基于CTB-VHH的OTA的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，主要研究結果如下：
　　1．二價及五價納米抗體的原核表達及活性分析
　　成功構建二價納米抗體GST-VHH及五價納米抗體CTB-VHH表達菌株，并進行IPTG誘導表達，經(jīng)純化后得到純度較高的GST-VHH及CTB-VHH。通過

4、SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，GST-VHH主要以單體形式存在，CTB-VHH主要以五聚體形式存在。經(jīng)間接競爭ELISA測定得到GST-VHH、CTB-VHH的IC50分別為2.11 ng/mL、0.65 ng/mL。通過不同溫度梯度下孵育一段時間后進行ELISA測定GST-VHH及CTB-VHH的熱穩(wěn)定性，結果表明GST-VHH于50.21℃下孵育5 min后失去一半活性，CTB-VHH于65.64℃下孵育5 min后失去一半活性，二者耐

5、熱性較VHH單體均有一定程度下降。
　　2．五價納米抗體CTB-VHH的應用研究
　　建立了基于CTB-VHH的間接競爭ELISA檢測方法，IC500.65 ng/mL，線性范圍0.27~1.58 ng/mL，LOD0.095 ng/mL。本研究建立的檢測方法與其他真菌毒素無明顯交叉反應，批內(nèi)加標回收率80.0~108.4％，批內(nèi)變異系數(shù)2.51~7.48%，批間加標回收率84.7~99.6%，批間變異系數(shù)2.61~4.79