赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B-,1-的超微量免疫分析.pdf

1、采用時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)技術(shù)，建立赭曲霉毒素A(OTA)和黃曲霉毒素B1(AFB1)的高靈敏的TRFIA的檢測(cè)方法，并研制具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的快速、靈敏的OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA檢測(cè)試劑盒，提高我國(guó)在毒素超微量免疫檢測(cè)的水平，解決我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)方面的一些迫切要求，應(yīng)對(duì)國(guó)際上技術(shù)壁壘的挑戰(zhàn)。 方法 1.OTA的TRFIA研究：首先采用碳二亞胺法，制備人工抗原OTA-KLH。以O(shè)TA-KL

2、H免疫大白兔制備多克隆抗體。以O(shè)TA-BSA免疫BALB/c鼠，制備抗OTA單克隆抗體。選擇包被濃度、標(biāo)記條件、反應(yīng)步驟、反應(yīng)方式，配制增強(qiáng)液、洗液，編制全自動(dòng)操作軟件；以稀土離子Eu3+標(biāo)記的羊抗兔抗體進(jìn)行示蹤，建立多克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)OTA-TRFIA。以稀土離子Eu3+標(biāo)記的羊抗鼠抗體進(jìn)行示蹤，建立單克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)OTA-TRFIA。組建OTA-TRFIA檢測(cè)試劑盒。按照標(biāo)記免疫試劑要求，分別對(duì)OTA-TRFIA試劑盒進(jìn)行靈敏度、

3、精密度、準(zhǔn)確度、回收率、特異性、穩(wěn)定性考核，應(yīng)用OTA-TRFIA試劑盒檢測(cè)國(guó)際質(zhì)控，并與進(jìn)口的OTA-ELISA試劑盒進(jìn)行對(duì)照。 2.AFB1的TRFIA研究：將AFB1-BSA免疫新西蘭大白兔得到抗AFB1多克隆抗體。用黃曲霉毒素B1與辣根過(guò)氧化酶的聯(lián)結(jié)物(AFB1-HRP)包被96孔板為固相抗原，以稀土離子Eu3+標(biāo)記的羊抗兔抗體進(jìn)行示蹤，采用間接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法建立AFB1-TRFIA。組建AFB1-TRFIA檢測(cè)試劑盒

4、，對(duì)其進(jìn)行考核，并與ELISA試劑盒進(jìn)行對(duì)照。 結(jié)果 1.制備了可以用于免疫和篩選的OTA-KLH人工抗原，得到了抗OTA多克隆抗體和單克隆抗體。采用DTTA法，制備了Eu3+-羊抗兔抗體和Eu3+-羊抗鼠抗體。配制了所有的相關(guān)試劑，編制了全自動(dòng)的分析軟件，組建了OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA檢測(cè)試劑盒。 2.應(yīng)用多克隆抗體建立的OTA-TRFIA方法的靈敏度為0.02μg/L，測(cè)量范圍為0.02μg/

5、L-400μg/L，批內(nèi)和批間變異分別為2.6％和5.2％，平均回收率為95.8％。OTA-TRFIA的效應(yīng)點(diǎn)值ED80、ED50、ED20分別為0.195g/L，1.018g/L和5.314g/L。 3.應(yīng)用單克隆抗體建立的OTA-TRFIA方法的靈敏度為0.03μg/L，測(cè)量范圍為0.03μg/L-1000μg/L，批內(nèi)和批間變異分別為3.7％和5.3％，平均回收率為94.2％。間接競(jìng)爭(zhēng)OTA-TRFIA的效應(yīng)點(diǎn)均值ED80

6、、ED50、ED20分別為0.33±0.02μg/L、1.44±0.08μg/L和5.22±0.12μg/L，樣品經(jīng)TRFIA和進(jìn)口的ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)OTA，兩者的相關(guān)系數(shù)為0.925，結(jié)果相符。 4.OTA-TRFIA試劑盒測(cè)定英國(guó)環(huán)境食品和農(nóng)產(chǎn)品部中心科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供的OTA質(zhì)控，結(jié)果為理論靶值的0.94-1.14，符合0.56-1.44之間的要求，說(shuō)明OTA-TRFIA可以用于谷物中OTA的檢測(cè)。 5.應(yīng)用多

7、克隆抗體建立的AFB1-TRFIA方法的靈敏度達(dá)到0.0039μg/L，AFB1-TRFIA的效應(yīng)點(diǎn)均值ED80、ED50、ED20分別為0.034±0.004μg/L、0.160±0.011μg/L、1.048±0.170μg/L，方法的批內(nèi)、批間變異系數(shù)平均為4.9％和8.9％。平均回收率為97.2％，AFB1-TRFIA和AFB1-ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)樣品，兩者的相關(guān)系數(shù)為0.917，說(shuō)明結(jié)果相符。 6.采用加速實(shí)驗(yàn)的

8、方法考核OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA試劑盒，其有效期可在一年以上，而且可以耐受夏天高溫的郵寄。 結(jié)論 1.研究表明，國(guó)內(nèi)外首先報(bào)導(dǎo)的OTA-TRFIA是目前OTA檢測(cè)中最靈敏的方法之一，該分析方法穩(wěn)定性好、可測(cè)范圍寬、大大好于OTA-ELISA商品化試劑盒。測(cè)定英國(guó)環(huán)境食品和農(nóng)產(chǎn)品部中心科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供的OTA質(zhì)控，結(jié)果高度符合，可以用于谷物中OTA的實(shí)際檢測(cè)，具有很好的應(yīng)用前景。 2.AFB1-TRF