碳離子束輻照谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)菌株選育研究.pdf

1、本論文選用中國科學院近代物理研究所蘭州重離子加速器國家重點實驗室(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou，HIRFL)提供的能量為80 MeV/u的12C6+離子束輻照誘變谷氨酸生產(chǎn)菌——谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，先后使用高葡萄糖(Glucose)、高谷氨酸(Glutamic Acid)、谷氨酰胺(Glutamine)、琥珀酸(Succinic Acid)

2、等配制選擇性培養(yǎng)基初步篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵潛力的谷氨酸生產(chǎn)菌株，然后進行24孔深孔細胞培養(yǎng)板進行高通量發(fā)酵初篩實驗，最后通過搖瓶發(fā)酵復篩實驗選育出谷氨酸生產(chǎn)量提高的突變菌株，并進行穩(wěn)定性傳代實驗，以期獲得一些其它誘變方法難以獲得的高產(chǎn)谷氨酸突變菌株，擬解決谷氨酸工業(yè)生產(chǎn)中存在的糖酸轉化率低等問題。同時用分子生物學方法研究玉米漿添加量對突變菌株谷氨酸合成代謝關鍵酶基因的影響，探討谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)時的代謝機制，為進一步提高谷氨酸產(chǎn)量奠定

3、一定的分子生物學研究基礎。
　　通過本論文的實驗研究，得到了以下初步結果：
　　1.菌體在完全培養(yǎng)基中活化生長8-9 h，處于對數(shù)生長期的中后期，此時菌體的繁殖能力比較強，菌體 OD660值約為0.200-0.220(菌體濃度約為108個菌)，菌濃度相對較大，生物活性較高，是輻照誘變的最佳時機。谷氨酸棒桿菌對重離子輻照較為敏感，輻照后存活率急劇下降，在600 Gy劑量下，致死率達90％。
　　2.利用選擇性平板篩選具有

4、特殊抗性的突變菌株，不僅使得誘變實驗目的增強，而且大大減少了工作量。通過重離子輻照后篩選獲得耐高糖、耐高溫等抗性菌株共146株，其中200-400 Gy輻照劑量下獲得的突變體有77株，占突變體總數(shù)的52.74%。
　　3.初步實驗表明，利用24孔深孔細胞培養(yǎng)板進行谷氨酸微量發(fā)酵實驗具有可行性，可替代搖瓶初篩實驗，加快了篩選效率。經(jīng)過發(fā)酵條件實驗得到24孔板最佳裝液量為1.2 mL，最佳種子培養(yǎng)時間為8-9 h，將該技術應用于谷氨酸

5、菌種產(chǎn)酸初篩取得較好的結果，共獲得產(chǎn)酸高于對照的突變體15株。再進行搖瓶復篩，發(fā)現(xiàn) G007號突變體產(chǎn)酸最高，發(fā)酵產(chǎn)酸達42.83 g/L，高于對照10.38%，命名為 GM001。經(jīng)過發(fā)酵穩(wěn)定性實驗，GM001遺傳性狀穩(wěn)定。
　　4.通過對影響谷氨酸生產(chǎn)菌產(chǎn)酸的幾個重要因素(葡萄糖濃度、玉米漿濃度、初始尿素添加量、培養(yǎng)溫度、溶氧、pH值)進行優(yōu)化研究，同時通過正交實驗得出最佳培養(yǎng)基配比及發(fā)酵條件為：葡萄糖200 g/L，玉米漿6

6、.0 g/L，初始尿素3.0 g/L，溫度32-38℃，搖床轉速(溶氧)120-200 r/mim，初始 pH值6.5-8.0。
　　5.通過重離子輻照得到高產(chǎn)谷氨酸突變菌株 GM001，生長速率提高，發(fā)酵對數(shù)期提前，對縮短發(fā)酵周期，降低發(fā)酵成本有積極的作用。發(fā)酵38 h后，谷氨酸產(chǎn)率達到121.1 g/L，與出發(fā)菌株酸度值相比提高了10.09%，葡萄糖利用率也提高至94.72%。GM001連續(xù)發(fā)酵5次，最后產(chǎn)酸穩(wěn)定在119.8

7、g/L-121.1 g/L，與原始菌種相比，提高約10.0%，可以看出 GM001是一株很有前景的工業(yè)生產(chǎn)菌株。
　　6.通過不同玉米漿濃度對谷氨酸發(fā)酵關鍵酶表達影響的研究，發(fā)現(xiàn)玉米漿濃度對谷氨酸發(fā)酵關鍵酶具有顯著地影響。玉米漿濃度在生長時期和產(chǎn)酸時期對各種關鍵酶基因表達的影響不同，如在菌體生長時期，異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase，IDH)的表達隨玉米漿濃度的升高而降低；而在產(chǎn)酸期，異檸檬酸脫氫酶