保加利亞乳桿菌代謝組學(xué)樣品的前處理研究.pdf

1、乳酸菌在食品工業(yè)中有悠久的歷史，已被廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、青貯飼料、谷物和果蔬等的加工生產(chǎn)中，解析其生理代謝特性對于改善菌株的生產(chǎn)性狀具有重要的指導(dǎo)意義。研究其代謝組學(xué)需要可靠的、可重現(xiàn)的和全面的分析細胞內(nèi)具有較寬動力學(xué)濃度范圍和化學(xué)功能各異的代謝產(chǎn)物，這就對從采樣、淬滅、代謝產(chǎn)物的提取到代謝物的定量分析這整個實驗過程提出了嚴格的要求。本研究以具有重要工業(yè)應(yīng)用價值的保加利亞乳桿菌為研究對象，構(gòu)建了小型快速取樣裝置，篩選了簡單、快速的

2、評價淬滅時代謝物泄露的指標，比較了三種淬滅液造成的代謝物泄露情況，并首次嘗試了冷熱結(jié)合提取法。該研究成果可為乳酸菌代謝組學(xué)的采樣、淬滅和提取研究提供理論依據(jù)，從而有助于完善乳酸菌代謝的生理學(xué)和遺傳學(xué)概貌。
　　 1、構(gòu)建代謝組學(xué)快速取樣裝置
　　 本研究構(gòu)建的自動快速取樣裝置主要包括空氣壓縮機，三通電磁閥、微控制器和采樣管等。通過控制空氣的壓力和通氣時間，來調(diào)整采樣體積，采樣間隔時間可小于5s。同時，可根據(jù)實驗需要在收集

3、管內(nèi)裝有淬滅劑和干冰等冷卻劑，即可對進入的生物樣本進行即時淬滅和快速降溫。
　　 2、淬滅方法的比較分析
　　 本研究通過分析菌體細胞的完整性和胞內(nèi)代謝物的泄露率，評價了60％甲醇/水(-40℃)、80％甲醇/水(-40℃)和80％甲醇/甘油(-40℃)三種淬滅方式。由流式細胞實驗、OD回收率實驗和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)實驗發(fā)現(xiàn)三種淬滅液都造成了胞內(nèi)代謝物泄露，但是高濃度的80％冷甲醇/水有助于減輕胞內(nèi)代謝物泄露的發(fā)生。

4、雖然甘油也可以減少胞內(nèi)代謝物的泄露，但因其難以被除去且掩蓋了很多其它的代謝物，并不適于GC-MS分析。另外，酶法檢測LDH的實驗結(jié)果與整體趨勢相矛盾，推測LDH可能不適于作為評價代謝物泄露的科學(xué)指標。細胞完整性可以作為評價淬滅時代謝物泄露的簡便指標。
　　 3、提取方法的比較分析
　　 代謝組學(xué)提取要求最大程度和最大范圍的提取代謝物，從而真實的反映胞內(nèi)代謝情況。本研究比較了目前常用的冷甲醇液氮凍融法和熱乙醇提取法，并嘗試

5、了新的提取方法——冷熱結(jié)合提取法。通過GC-MS檢測和多元統(tǒng)計分析，包括PCA，OPLS-DA和差異代謝物，發(fā)現(xiàn)冷甲醇法提取氨基酸和短鏈有機酸類的效率優(yōu)于熱乙醇提取法，熱乙醇法提取長鏈有機酸和糖類的效率優(yōu)于冷甲醇法，兩種提取方法各有自身的提取特點。而新的冷熱結(jié)合法在提取氨基酸、有機酸類和糖類等方面的效率介于冷甲醇提取法與熱乙醇提取法之間，提取其它類代謝物方面超越了冷甲醇液氮凍融和熱乙醇法，并保留了冷甲醇提取法和熱乙醇法的提取特點。從獲得