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文檔簡介
1、共軛亞油酸(Conjugatede linoleic acid,CLA)是具有共軛雙鍵的18個碳原子的不飽和脂肪酸。CLA具有一系列的位置和幾何異構體,其中c9,t11-CLA和t10,c12-CLA兩種異構體被認為最具有生物活性,研究發(fā)現這兩種異構體具有抗腫瘤、抗粥樣動脈硬化、減肥、免疫調節(jié)、抗糖尿病等功能。共軛亞油酸天然存在較少,主要靠人工合成,生物法合成共軛亞油酸具有反應條件溫和,異構體成分單一的優(yōu)點,可用于食品和藥品的添加,而亞
2、油酸異構酶做為合成中的重要酶近年來成為研究的熱點。
本文以保加利亞乳桿菌亞油酸異構酶為研究對象,首先在產物分析鑒定的基礎上,對保加利亞乳桿菌誘導產酶條件進行了研究,其次研究酶的分離純化條件和酶學性質,并對酶的反應體系進行了初步研究。
氣質聯用色譜和液相色譜檢測結果表明:保加利亞乳桿菌亞油酸異構酶可以合成CLA,其中含有兩種異構體,主要產物為c9,t11-CLA。
誘導產酶條件研究表明,在脫脂乳培
3、養(yǎng)基中添加1.5‰(v/v)LA所產酶的共軛亞油酸轉化率最高;溫度為36℃,培養(yǎng)36h為較適的培養(yǎng)條件;單獨添加0.1%(m/v)的乳糖或0.1%(m/v)的氯化鈉有利于誘導產酶;在培養(yǎng)基中直接添加LA的效果優(yōu)于培養(yǎng)3至12h后再進行添加。
亞油酸異構酶的最佳提取條件為,以0.7%(m/v)的量添加溶菌酶(30℃,1h),然后在冰水浴中超聲破碎(超聲3S,間歇4S,90次,功率400W)。粗酶液經過40~80%飽和度的硫酸
4、銨進行鹽析,millipore超濾管進行超濾,SephadexG-100凝膠過濾層析的步驟進行分離純化后,酶的純化倍數達到5.17倍,比活力為244.78[U/mg]。純化后的亞油酸異構酶在SDS-PAGE電泳中只有一條條帶,達到電泳純度,分子量為42.69KDa。
亞油酸異構酶的酶學特性表明:保加利亞乳桿菌亞油酸異構酶的最適反應溫度為40℃,在20~40℃范圍內酶有較高的穩(wěn)定性;最適反應pH值為4.0,pH值在3.0~6
5、.0范圍內有較高的穩(wěn)定性;低濃度(0.01mol/L)的金屬離子Ca2+,Zn2+,Mg2+可利于亞油酸異構酶的催化反應,其影響順序分別為Ca2+>Zn2+>Mg2+;高濃度(0.02mol/L)的SDS有利于亞油酸異構酶的純化反應;以亞油酸為底物的酶促反應動力學方程得到,Km=3.87mmol/L,Vmax=4.35mmol/mL·h。
亞油酸異構酶反應體系初步研究表明:保加利亞乳桿菌亞油酸異構酶在緩沖液體系下CLA轉化
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