弱后酸化保加利亞乳桿菌的應(yīng)激性及其遺傳穩(wěn)定性研究.pdf

1、乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細菌的通稱，在食品工業(yè)和醫(yī)療保健等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。但其自然菌株往往不具備工業(yè)生產(chǎn)所需要的各種優(yōu)良性狀或者性狀不顯著。因此需要使用定向培育、誘變育種和細胞融合等育種方法來選育性狀優(yōu)良的菌株。用于制造酸奶的德氏乳桿菌保加利亞亞種是導致酸奶后酸化的主要誘因，酸奶的后酸化會導致酸奶出現(xiàn)消費者不可接受的過酸味及感官質(zhì)量下降，影響酸奶的長期貯存，因此利用誘變育種來篩選弱后酸化德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵劑菌

2、株并對其遺傳穩(wěn)定性進行檢測對直投式酸奶發(fā)酵劑的工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。
　　 本課題包括以下幾個實驗：H+-ATPase缺陷突變菌株的誘變、酸應(yīng)激及冷應(yīng)激對親本和突變菌株生長及質(zhì)膜H+-ATPase活性的影響、突變菌株遺傳穩(wěn)定性實驗、H+-ATPase缺陷突變菌株的代謝動力學、親本和突變菌株H+-ATPase表達的比較、弱后酸化酸奶的研制。
　　 首先利用新霉素作為誘變壓力，從本實驗室選育的一株可用于制作酸奶發(fā)酵劑的德氏乳

3、桿菌保加利亞亞種KLDS1，9201篩選得到一株H+-ATPase缺陷的自發(fā)突變菌株，命名為KLDS1.9201-11。對KLDS1.9201和KLDS1.9201-11的生長情況和pH值進行測定，發(fā)現(xiàn)KLDS1.9201-11的生長速率明顯比KLDS1.9201的低，而且在生長過程中其pH值明顯高于KLDS1.9201，即產(chǎn)酸能力較弱。
　　 使用天根DP430細菌RNA提取試劑盒提取KLDS1.9201和KLDS1.9201

4、-11對數(shù)期和穩(wěn)定期的總RNA，經(jīng)DNasel(RNase-free)處理后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后使用實時熒光定量PCR檢測來測定KLDS1.9201和KLDS1.9201-11對數(shù)期和穩(wěn)定期中質(zhì)膜H+-ATPase的表達，結(jié)果表明，各菌株的H+-ATPase酶的表達量差異顯著(p<0.05)，其中，對數(shù)期的KLDS1.9201-11(突變菌株)的H+-ATPase酶的表達量約是KLDS1.9201(親本菌株)的24％，穩(wěn)定期的KLDS

5、1.9201-11(突變菌株)的H+-ATPase酶的表達量約是KLDS1.9201(親本菌株)的33%。
　　 對KLDS1.9201和KLDS1.9201-11進行酸應(yīng)激和冷應(yīng)激，在酸應(yīng)激后，KLDS1.9201和KLDS1.9201-11的存活率明顯下降，活菌數(shù)分別減少了86.98%和99.98%，H+-ATPase活性分別降低了13.33%和21.15%，KLDS1.9201-11表現(xiàn)出了更強的酸敏感性。在冷應(yīng)激后，KL

6、DS1.9201和KLDS1.9201-11的活菌數(shù)分別下降了76.71%和4.88%，親本菌株的H+-ATPase活性降低了4.27%，突變菌株的H+-ATPase活性上升了29.71%，這說明突變菌株的冷適應(yīng)性比親本菌株要好，這有利于直投式發(fā)酵劑的制作過程中活菌數(shù)的提高。
　　 使用天根公司的DNA提取試劑盒提取KLDS1.9201-11第一代至第八代的基因組DNA，并利用篩選出的5種引物對提取出的基因組DNA進行RAPD分

7、析。利用5種引物進行的突變菌株的RAPD分析產(chǎn)生的DNA指紋圖譜結(jié)果表明，在連續(xù)傳代8次后，突變菌株KLDS1.9201-11的基因組DNA指紋圖譜基本沒有變化，隨機擴增條帶數(shù)相同且亮度接近，說明其基因組DNA具有高度的同源性，并沒有隨著菌株弱后酸化能力的丟失而發(fā)生變化。
　　 通過高效液相色譜的方法對KLDS1.9201和KLDS1.9201-11的第一代到第十代的菌液中代謝產(chǎn)物進行分析，代謝產(chǎn)物包括葡萄糖和乳酸。結(jié)果表明，K

8、LDS1.9201的葡萄糖代謝率始終比KLDS1.9201-11高，乳酸產(chǎn)量也高。且KLDS1.9201-11能夠穩(wěn)定遺傳至第八代，到九代開始回復突變。
　　 選用嗜熱鏈球菌KLD3.9210分別與KLDS1.9201和KLDS1.9201-11進行混合培養(yǎng)制作酸奶。感官評定結(jié)果表明，無論在滋味/氣味、組織狀態(tài)和色澤等方面這兩種酸奶都沒有明顯的差異。貯存試驗結(jié)果表明，在4℃下保存21天后，使用KLDS1.9201-11制備的酸奶