利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)保加利亞乳桿菌ATCC11842后酸化分子機(jī)制的研究.pdf

1、酸奶是含有活菌的乳制品，在正常的發(fā)酵結(jié)束后，菌體仍會(huì)利用其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行新陳代謝，同時(shí)會(huì)繼續(xù)產(chǎn)酸，即發(fā)生后酸化。后酸化導(dǎo)致酸奶的口感下降、貨架期縮短，嚴(yán)重影響乳制品行業(yè)的發(fā)展。研究表明，保加利亞亞種是導(dǎo)致酸奶后酸化的直接原因，在酸奶發(fā)酵后期控制保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)代謝是解決后酸化的關(guān)鍵。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者展開了對(duì)后酸化機(jī)理的研究并取得了一定的成果，但研究主要集中在H+-ATP酶和β-半乳糖苷酶，而關(guān)于后酸化調(diào)控模型的研究未見報(bào)道。后酸

2、化導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)處于酸和冷脅迫，因此本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)對(duì)模式菌株保加利亞乳桿菌ATCC11842菌株在酸脅迫和冷脅迫的過程中參與后酸化的關(guān)鍵基因進(jìn)行分離鑒定，為全面揭示乳酸菌的酸耐受機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為工業(yè)生產(chǎn)中解決酸奶后酸化問題提供理論依據(jù)。
　　研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　(1)不同處理下保加利亞乳桿菌ATCC11842轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及測(cè)序質(zhì)量評(píng)估
　　對(duì)保加利亞乳桿菌(ATCC11842)進(jìn)

3、行酸脅迫及酸和冷的脅迫處理，樣品分別命名為T1和T2，對(duì)照未脅迫處理樣品命名為CK。分別提取各樣品RNA，逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。利用Illumina HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(reads)信息已經(jīng)提交到NCBI的SAR數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra_sub/sub.cgi)，CK（編號(hào)為:SRR3490433），T1(編號(hào)為:SRR34907

4、16)，T2(編號(hào)為:SRR3501037)。
　　(2)保加利亞乳桿菌脅迫過程qPCR內(nèi)參基因的篩選及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證
　　通過對(duì)保加利亞乳桿菌ATCC11842在空白處理(CK)、酸脅迫(T1)、酸和冷脅迫(T2)三種試驗(yàn)條件下的5個(gè)候選內(nèi)參基因(16s-rDNA、rpoB、ldh、rodA和recA)的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，通過三種常用的程序geNorm、NormFinder和Bestkeeper篩選出合適的內(nèi)參基

5、因用于后續(xù)試驗(yàn)熒光定量PCR數(shù)據(jù)的校正，最終確定rpoB基因和recA基因?yàn)楸驹囼?yàn)理想的內(nèi)參基因，并用篩選得到的內(nèi)參基因?qū)﹄S機(jī)選取的9個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示9個(gè)基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致，表明了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性及選取的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。
　　(3)保加利亞乳桿菌ATCC11842后酸化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平的分析
　　經(jīng)過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在樣品CK共有1503個(gè)基因參與表達(dá)，T

6、1中共有1506個(gè)基因參與表達(dá)。通過比較CK與T1之間表達(dá)譜的差異發(fā)現(xiàn)所有參與酸脅迫過程的基因。經(jīng)過差異分析，269個(gè)基因在酸脅迫（樣品T1）過程中上調(diào)，143個(gè)基因酸脅迫后下調(diào)，表明412個(gè)基因與酸脅迫過程有關(guān)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，T2中共有1504個(gè)基因參與表達(dá)過程，與空白處理(CK)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)比，在T2樣品中存在69個(gè)上調(diào)基因和33個(gè)下調(diào)基因。同時(shí)我們對(duì)412個(gè)酸響應(yīng)基因在冷脅迫下的基因表達(dá)量變化進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，參照轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)

7、果，酸響應(yīng)基因在冷脅迫下主要有以下幾種變化趨勢(shì):
　　a.冷脅迫處理后酸響應(yīng)基因的變化趨勢(shì)與酸脅迫處理下基本一致。
　　b.冷脅迫處理后酸響應(yīng)基因變?yōu)榉遣町惢颉?br>　　c.冷脅迫處理后酸響應(yīng)基因表達(dá)量下調(diào)。
　　統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，269個(gè)上調(diào)表達(dá)的酸響應(yīng)基因，冷脅迫處理后，57個(gè)基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，說明冷脅迫并未影響這些酸響應(yīng)基因的表達(dá);207個(gè)上調(diào)酸響應(yīng)基因在經(jīng)過冷脅迫后，表達(dá)量差異不顯著，說明冷脅迫使這

8、些基因退出酸響應(yīng)過程;而其中的5個(gè)基因在冷脅迫后，表達(dá)量顯著下調(diào)，表明冷脅迫嚴(yán)重抑制了這些酸響應(yīng)基因的表達(dá)。同樣，酸脅迫下表達(dá)量下調(diào)的143個(gè)基因中，冷脅迫處理后，17個(gè)基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，說明冷脅迫并未影響這些酸響應(yīng)基因的表達(dá)，126個(gè)下調(diào)酸響應(yīng)基因在經(jīng)過冷脅迫后，表達(dá)量差異不顯著，說明冷脅迫使這些基因退出酸響應(yīng)過程。進(jìn)一步我們認(rèn)為上調(diào)表達(dá)的57個(gè)和下調(diào)表達(dá)的17個(gè)酸響應(yīng)基因在受冷脅迫處理后仍然參與酸響應(yīng)過程，正如酸奶發(fā)酵結(jié)