豪氏變形桿菌功能性蛋白探究及基因重組表達(dá).pdf

1、隨著環(huán)境污染和能源短缺的加劇，開(kāi)發(fā)清潔環(huán)境友好型的新能源是當(dāng)務(wù)之急，豪氏變形桿菌(Proteushauseri)ZMd44作為一株新穎的產(chǎn)電菌，其能同步進(jìn)行偶氮染料降解和生物產(chǎn)電，在未來(lái)環(huán)境保護(hù)和能源供給應(yīng)用具有較大潛力。
　　本研究提出用微生物環(huán)境刺激的方式，系統(tǒng)研究金屬離子、染料濃度及介質(zhì)對(duì)豪氏變形桿菌降解染料速率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明添加5mM金屬離子時(shí)，金屬離子抑制偶氮染料降解速率順序:Cu2+＞Zn2+＞Mn2+＞Co2+

2、＞K+=Na+，其中Cu2+和Zn2+對(duì)偶氮染料降解有強(qiáng)烈的抑制作用，而K+和Na+基本無(wú)影響。豪氏變形桿菌對(duì)偶氮染料降解呈兩級(jí)反應(yīng)，不同濃度染料的比脫色速率擬合類(lèi)米氏方程V=Vmax[Dye]/(Km+[Dye])，得到Vmax=93.6mg/L/h/g-DCW;Km=326mg/L。豪氏變形桿菌全細(xì)胞、胞內(nèi)蛋白及胞外蛋白在以LB培養(yǎng)基為介質(zhì)的脫色體系中偶氮染料的降解率超過(guò)90％，而在無(wú)菌水體系中偶氮染料無(wú)降解，培養(yǎng)基中酵母提取物和蛋

3、白胨是重要的氧化還原介質(zhì)。
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)硫酸銅能誘導(dǎo)豪氏變形桿菌產(chǎn)生漆酶McoA-laccase，最佳誘導(dǎo)條件為在接種或?qū)?shù)生長(zhǎng)期前期添加3mM的硫酸銅進(jìn)行誘導(dǎo)。而且隨著硫酸銅誘導(dǎo)濃度的增加，全細(xì)胞和胞內(nèi)漆酶的酶活也遞增，這可能是由于銅離子提高了豪氏變形桿菌的漆酶基因轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)利用生成的漆酶來(lái)提高其銅抗性。通過(guò)電子自旋共振分析漆酶McoA-laccase含有典型的T1和T2銅位點(diǎn)，其最佳反應(yīng)溫度和pH分別為60℃和2.2

4、，分析表明此酶在溫度低于50℃和微酸性環(huán)境下活性較為穩(wěn)定。
　　應(yīng)用一維蛋白電泳耦合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析鑒定豪氏變形桿菌在不添加或添加3mM硫酸銅培養(yǎng)時(shí)的全細(xì)胞和周質(zhì)蛋白的差異蛋白，比較10條差異蛋白的信息，其中銅傳輸ATPase，磷酸烯醇式丙酮酸激酶，鞭毛蛋白和外膜蛋白是可能與銅平衡相關(guān)的蛋白。亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析清晰地展現(xiàn)了在不同亞細(xì)胞組分（細(xì)胞質(zhì)，周質(zhì)和細(xì)胞碎片）與銅平衡相關(guān)蛋白在不同硫酸銅濃度(0-4mM)

5、條件下蛋白表達(dá)量趨勢(shì)，其變化趨勢(shì)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果一致。與不添加硫酸銅相比，豪氏變形桿菌在含3mM硫酸銅的LB平板上生長(zhǎng)時(shí)群集運(yùn)動(dòng)性大大減少，并且電子掃描顯微鏡觀察到細(xì)菌分泌物在添加硫酸銅后也大量減少，這使得銅可以制成金屬藥物應(yīng)用于變形桿菌感染的靶向治療。本研究成功重組表達(dá)漆酶（多銅氧化酶）的基因lac2，經(jīng)過(guò)硫酸銅和乳糖的雙重誘導(dǎo)培養(yǎng)后才會(huì)大量表達(dá)有活性的漆酶。
　　本研究初步探討豪氏變形桿菌的對(duì)偶氮染料降解的影響因素，