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1、小RNA是指一類小片段的非編碼RNA,主要通過(guò)RNA-RNA相互作用而對(duì)目標(biāo)RNA進(jìn)行調(diào)控,其中最重要和被廣泛研究的作用即RNAi。RNAi是指由RNA分子介導(dǎo)的基因抑制,其包含了兩大類RNA分子:microRNA和siRNA。microRNA是一類內(nèi)源性的~22 nt的非編碼小RNA,在生物體中廣泛存在并具有高度的保守性,主要通過(guò)與mRNA的3'UTR結(jié)合,抑制基因翻譯或者誘導(dǎo)mRNA的降解。siRNA是一類外源性或人工合成的~22
2、nt的非編碼小RNA,其作用機(jī)制與microRNA相似,但可與目標(biāo)mRNA的任意部位結(jié)合并介導(dǎo)mRNA的降解。RNAi在基因功能研究和疾病治療方面都有廣泛的應(yīng)用,目前已有多種基于RNAi的藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。RNA適配體(RNA aptamer)是指能與給定的特定分子相結(jié)合的小片段的RNA,主要通過(guò)體外SELEX(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment)篩選而成。由
3、于RNA適配體對(duì)其目標(biāo)分子具有高度的特異性和親和性,因而在生物化學(xué)的研究和疾病的治療中有著廣闊的應(yīng)用前景,且已有RNA適配體(Pegaptanib)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)。目前用于RNAi和適配體研究的RNA試劑,主要采用化學(xué)或體外轉(zhuǎn)錄合成,成本較高。本課題通過(guò)生物技術(shù)的方法,成功構(gòu)建OnRS(optimal noncoding RNA scaffold)骨架,并用于在大腸桿菌中高表達(dá)了具有生物學(xué)功能的microRNA,siRNA
4、和RNA適配體,為RNA的研究提供了一種經(jīng)濟(jì)快捷高效的合成手段。本研究主要內(nèi)容包括:
?、艠?gòu)建含有不同的microRNA前體片段的質(zhì)粒,通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌來(lái)表達(dá)不同的microRNA前體。首先利用人的基因組DNA為模板,根據(jù)不同的microRNA前體的序列設(shè)計(jì)不同的引物以擴(kuò)增前體片段,采用無(wú)縫克隆(seamless cloning)的方法分別構(gòu)建表達(dá)各個(gè)microRNA前體的質(zhì)粒。將構(gòu)建好的質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行RNA的
5、表達(dá),提取細(xì)菌中的總RNA,通過(guò)變性聚丙烯酰胺/尿素凝膠電泳鑒定目標(biāo)的microRNA前體在細(xì)菌總RNA中的表達(dá)量,結(jié)果顯示,除了tRNA/mir-34a,tRNA/mir-125b-1和tRNA/mir-1291之外,其余重組RNA在細(xì)菌總RNA中的表達(dá)量相當(dāng)?shù)?,有的甚至沒(méi)有表達(dá)。由于在所測(cè)定的11個(gè)microRNA前體的表達(dá)中,mir-34a的表達(dá)量最高,為了用這個(gè)系統(tǒng)大量表達(dá)其他的microRNA,我們采用不同microRNA的成
6、熟序列替換microRNA34a前體中miR-34a,再根據(jù)microRNA34a前體中的堿基配對(duì)方式同時(shí)改變其3'序列,并將這個(gè)新的結(jié)構(gòu)命名為OnRS。
?、评肙nRS的原理,將miR-124的序列替換microRNA34a前體中miR-34a的序列擬構(gòu)建能在大腸桿菌中表達(dá)含有miR-124序列的重組RNA的質(zhì)粒OnRS/miR-124,并同時(shí)插入一段隨機(jī)序列構(gòu)建一個(gè)實(shí)驗(yàn)所需的對(duì)照質(zhì)粒OnRS/Neg。將構(gòu)建好的質(zhì)粒測(cè)序鑒定
7、后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,提取總RNA,電泳鑒定,結(jié)果顯示目的RNA能在大腸桿菌中大量表達(dá)。用FPLC(fast protein liquidchromatography)純化目的重組RNA后,將OnRS/miR-124轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,兩天后收集細(xì)胞,提取總RNA,進(jìn)行小RNA的深度測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明,OnRS/miR-124能在細(xì)胞中被加工產(chǎn)生成熟的miR-124,細(xì)胞中其余小RNA的表達(dá)未發(fā)生明顯變化,同時(shí)OnRS/miR-124中的tR
8、NA也能在細(xì)胞中被加工成tRFs(tRNA fragments),且不同重組RNA之間tRFs的量無(wú)明顯差異。確定OnRS/miR-124能在細(xì)胞中產(chǎn)生出大量成熟的miR-124序列后,進(jìn)一步對(duì)其功能進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,miR-124的靶蛋白STAT3和p-STAT3能被OnRS/miR-124所抑制,且OnRS/miR-124能夠抑制細(xì)胞的增殖,同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,與文獻(xiàn)報(bào)道相符合。上述結(jié)果表明,利用OnRS能夠成功在大腸桿菌中表達(dá)具有
9、生物學(xué)功能的microRNA。
⑶確定OnRS能夠成功表達(dá)microRNA后,鑒于microRNA和siRNA有著相似的作用機(jī)制,本課題進(jìn)一步探索其是否能用于siRNA的表達(dá)。本章利用OnRS的原理,設(shè)計(jì)并構(gòu)建了能表達(dá)一段22 nt的GFP-siRNA的質(zhì)粒OnRS/GFP-siRNA,質(zhì)粒通過(guò)測(cè)序鑒定正確后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,提取總RNA,經(jīng)電泳鑒定,結(jié)果表明重組RNA在大腸桿菌中大量表達(dá)。通過(guò)FPLC純化后,將OnRS/GFP
10、-siRNA轉(zhuǎn)染ES-2 GFP細(xì)胞,兩天后提取總RNA進(jìn)行小RNA的深度測(cè)度。測(cè)序結(jié)果表明OnRS/GFP-siRNA能在細(xì)胞中被加工產(chǎn)生成熟的GFP-siRNA,細(xì)胞中其余小RNA的表達(dá)未發(fā)生明顯變化,OnRS/GFP-siRNA中的tRNA也能在細(xì)胞中被加工成tRFs,且不同重組RNA之間tRFs的量無(wú)明顯差異。同時(shí),OnRS/GFP-siRNA轉(zhuǎn)染ES-2 GFP細(xì)胞,48 h及72 h之后都能發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組相比細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯
11、降低,轉(zhuǎn)染72 h后測(cè)定GFP的mRNA表達(dá)同對(duì)照組相比明顯降低。在確定OnRS/GFP-siRNA體外能有效抑制GFP的表達(dá)之后,進(jìn)一步進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。對(duì)于高表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠靜脈注射OnRS/GFP-siRNA和對(duì)照的OnRS/Neg,取小鼠肝臟,冷凍切片,觀察OnRS/GFP-siRNA比對(duì)照組熒光強(qiáng)度明顯降低,同時(shí)測(cè)定肝臟中GFP mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比也有顯著降低。上述結(jié)果表明,利用OnRS能夠成功在大腸桿菌中表
12、達(dá)具有生物學(xué)功能的siRNA。
⑷探索是否能利用OnRS表達(dá)功能性的RNA適配體。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)了能在OnRS的5'端或3'端表達(dá)孔雀石綠(malachite green,MG)適配體(MGA)的質(zhì)粒OnRS/MGA5和OnRS/MGA3。轉(zhuǎn)化細(xì)菌后提取總RNA鑒定,OnRS/MGA5和OnRS/MGA3都能在大腸桿菌中大量表達(dá)且能與MG結(jié)合皆能使MG的最大吸收從618 nm轉(zhuǎn)移到630 nm,同時(shí)也能增強(qiáng)MG在630/655
13、nm處的熒光。在確定OnRS能成功表達(dá)出功能性的MGA后,進(jìn)一步考察了OnRS/MGA5在測(cè)定核糖核酸酶活性方面的應(yīng)用。首先確定熒光強(qiáng)度能隨著MG和OnRS/MGA5濃度的增加而不斷升高。同時(shí),OnRS/MGA5能被人體中主要的核糖核酸酶RNase A和血管生成素(Angiogenin)所降解。在確定OnRS/MGA5能被核糖核酸酶降解后,由于血清中富含多種核糖核酸酶,故進(jìn)一步測(cè)定血清對(duì)OnRS/MGA5的降解。結(jié)果發(fā)現(xiàn),OnRS/MG
14、A5能被血清中的核糖核酸酶所降解,且熒光值與血清的量之間呈現(xiàn)經(jīng)典的劑量-效應(yīng)關(guān)系,同時(shí)加入核糖核酸酶抑制劑可使OnRS/MGA5與MG結(jié)合的熒光值保持不變。另外,基因傳遞試劑in vivo-jetPEI也能有效抑制血清中核糖核酸酶對(duì)OnRS/MGA5的降解。因此,擬采用OnRS/MGA5作為一個(gè)無(wú)標(biāo)記的底物來(lái)測(cè)定不同病人血清樣品中Rnase的活性。測(cè)定發(fā)現(xiàn),胰腺癌病人血清中核糖核酸酶的活力(196±22)明顯高于良性或正常人(118±8
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