大腸桿菌高表達(dá)攜帶功能性小RNA的重組RNA方法的建立.pdf

1、小RNA是指一類小片段的非編碼RNA，主要通過RNA-RNA相互作用而對目標(biāo)RNA進(jìn)行調(diào)控，其中最重要和被廣泛研究的作用即RNAi。RNAi是指由RNA分子介導(dǎo)的基因抑制，其包含了兩大類RNA分子:microRNA和siRNA。microRNA是一類內(nèi)源性的～22 nt的非編碼小RNA，在生物體中廣泛存在并具有高度的保守性，主要通過與mRNA的3'UTR結(jié)合，抑制基因翻譯或者誘導(dǎo)mRNA的降解。siRNA是一類外源性或人工合成的～22

2、nt的非編碼小RNA，其作用機(jī)制與microRNA相似，但可與目標(biāo)mRNA的任意部位結(jié)合并介導(dǎo)mRNA的降解。RNAi在基因功能研究和疾病治療方面都有廣泛的應(yīng)用，目前已有多種基于RNAi的藥物進(jìn)入臨床試驗。RNA適配體(RNA aptamer)是指能與給定的特定分子相結(jié)合的小片段的RNA，主要通過體外SELEX(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment)篩選而成。由

3、于RNA適配體對其目標(biāo)分子具有高度的特異性和親和性，因而在生物化學(xué)的研究和疾病的治療中有著廣闊的應(yīng)用前景，且已有RNA適配體(Pegaptanib)被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)。目前用于RNAi和適配體研究的RNA試劑，主要采用化學(xué)或體外轉(zhuǎn)錄合成，成本較高。本課題通過生物技術(shù)的方法，成功構(gòu)建OnRS(optimal noncoding RNA scaffold)骨架，并用于在大腸桿菌中高表達(dá)了具有生物學(xué)功能的microRNA，siRNA

4、和RNA適配體，為RNA的研究提供了一種經(jīng)濟(jì)快捷高效的合成手段。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、艠?gòu)建含有不同的microRNA前體片段的質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌來表達(dá)不同的microRNA前體。首先利用人的基因組DNA為模板，根據(jù)不同的microRNA前體的序列設(shè)計不同的引物以擴(kuò)增前體片段，采用無縫克隆(seamless cloning)的方法分別構(gòu)建表達(dá)各個microRNA前體的質(zhì)粒。將構(gòu)建好的質(zhì)粒測序驗證后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行RNA的

5、表達(dá)，提取細(xì)菌中的總RNA，通過變性聚丙烯酰胺/尿素凝膠電泳鑒定目標(biāo)的microRNA前體在細(xì)菌總RNA中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，除了tRNA/mir-34a，tRNA/mir-125b-1和tRNA/mir-1291之外，其余重組RNA在細(xì)菌總RNA中的表達(dá)量相當(dāng)?shù)?，有的甚至沒有表達(dá)。由于在所測定的11個microRNA前體的表達(dá)中，mir-34a的表達(dá)量最高，為了用這個系統(tǒng)大量表達(dá)其他的microRNA，我們采用不同microRNA的成

6、熟序列替換microRNA34a前體中miR-34a，再根據(jù)microRNA34a前體中的堿基配對方式同時改變其3'序列，并將這個新的結(jié)構(gòu)命名為OnRS。
　?、评肙nRS的原理，將miR-124的序列替換microRNA34a前體中miR-34a的序列擬構(gòu)建能在大腸桿菌中表達(dá)含有miR-124序列的重組RNA的質(zhì)粒OnRS/miR-124，并同時插入一段隨機(jī)序列構(gòu)建一個實驗所需的對照質(zhì)粒OnRS/Neg。將構(gòu)建好的質(zhì)粒測序鑒定

7、后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取總RNA，電泳鑒定，結(jié)果顯示目的RNA能在大腸桿菌中大量表達(dá)。用FPLC(fast protein liquidchromatography)純化目的重組RNA后，將OnRS/miR-124轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，兩天后收集細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)行小RNA的深度測序。測序結(jié)果表明，OnRS/miR-124能在細(xì)胞中被加工產(chǎn)生成熟的miR-124，細(xì)胞中其余小RNA的表達(dá)未發(fā)生明顯變化，同時OnRS/miR-124中的tR

8、NA也能在細(xì)胞中被加工成tRFs(tRNA fragments)，且不同重組RNA之間tRFs的量無明顯差異。確定OnRS/miR-124能在細(xì)胞中產(chǎn)生出大量成熟的miR-124序列后，進(jìn)一步對其功能進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，miR-124的靶蛋白STAT3和p-STAT3能被OnRS/miR-124所抑制，且OnRS/miR-124能夠抑制細(xì)胞的增殖，同時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與文獻(xiàn)報道相符合。上述結(jié)果表明，利用OnRS能夠成功在大腸桿菌中表達(dá)具有

9、生物學(xué)功能的microRNA。
　　⑶確定OnRS能夠成功表達(dá)microRNA后，鑒于microRNA和siRNA有著相似的作用機(jī)制，本課題進(jìn)一步探索其是否能用于siRNA的表達(dá)。本章利用OnRS的原理，設(shè)計并構(gòu)建了能表達(dá)一段22 nt的GFP-siRNA的質(zhì)粒OnRS/GFP-siRNA，質(zhì)粒通過測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取總RNA，經(jīng)電泳鑒定，結(jié)果表明重組RNA在大腸桿菌中大量表達(dá)。通過FPLC純化后，將OnRS/GFP

10、-siRNA轉(zhuǎn)染ES-2 GFP細(xì)胞，兩天后提取總RNA進(jìn)行小RNA的深度測度。測序結(jié)果表明OnRS/GFP-siRNA能在細(xì)胞中被加工產(chǎn)生成熟的GFP-siRNA，細(xì)胞中其余小RNA的表達(dá)未發(fā)生明顯變化，OnRS/GFP-siRNA中的tRNA也能在細(xì)胞中被加工成tRFs，且不同重組RNA之間tRFs的量無明顯差異。同時，OnRS/GFP-siRNA轉(zhuǎn)染ES-2 GFP細(xì)胞，48 h及72 h之后都能發(fā)現(xiàn)和對照組相比細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯

11、降低，轉(zhuǎn)染72 h后測定GFP的mRNA表達(dá)同對照組相比明顯降低。在確定OnRS/GFP-siRNA體外能有效抑制GFP的表達(dá)之后，進(jìn)一步進(jìn)行了體內(nèi)實驗的驗證。對于高表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠靜脈注射OnRS/GFP-siRNA和對照的OnRS/Neg，取小鼠肝臟，冷凍切片，觀察OnRS/GFP-siRNA比對照組熒光強(qiáng)度明顯降低，同時測定肝臟中GFP mRNA的表達(dá)與對照組相比也有顯著降低。上述結(jié)果表明，利用OnRS能夠成功在大腸桿菌中表

12、達(dá)具有生物學(xué)功能的siRNA。
　?、忍剿魇欠衲芾肙nRS表達(dá)功能性的RNA適配體。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計了能在OnRS的5'端或3'端表達(dá)孔雀石綠(malachite green，MG)適配體(MGA)的質(zhì)粒OnRS/MGA5和OnRS/MGA3。轉(zhuǎn)化細(xì)菌后提取總RNA鑒定，OnRS/MGA5和OnRS/MGA3都能在大腸桿菌中大量表達(dá)且能與MG結(jié)合皆能使MG的最大吸收從618 nm轉(zhuǎn)移到630 nm，同時也能增強(qiáng)MG在630/655

13、nm處的熒光。在確定OnRS能成功表達(dá)出功能性的MGA后，進(jìn)一步考察了OnRS/MGA5在測定核糖核酸酶活性方面的應(yīng)用。首先確定熒光強(qiáng)度能隨著MG和OnRS/MGA5濃度的增加而不斷升高。同時，OnRS/MGA5能被人體中主要的核糖核酸酶RNase A和血管生成素(Angiogenin)所降解。在確定OnRS/MGA5能被核糖核酸酶降解后，由于血清中富含多種核糖核酸酶，故進(jìn)一步測定血清對OnRS/MGA5的降解。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OnRS/MG

14、A5能被血清中的核糖核酸酶所降解，且熒光值與血清的量之間呈現(xiàn)經(jīng)典的劑量-效應(yīng)關(guān)系，同時加入核糖核酸酶抑制劑可使OnRS/MGA5與MG結(jié)合的熒光值保持不變。另外，基因傳遞試劑in vivo-jetPEI也能有效抑制血清中核糖核酸酶對OnRS/MGA5的降解。因此，擬采用OnRS/MGA5作為一個無標(biāo)記的底物來測定不同病人血清樣品中Rnase的活性。測定發(fā)現(xiàn)，胰腺癌病人血清中核糖核酸酶的活力(196±22)明顯高于良性或正常人(118±8