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文檔簡(jiǎn)介
1、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis,P.mirabilis)屬于腸桿菌科、變形桿菌屬,是革蘭氏陰性細(xì)菌,廣泛存在于自然界和人與動(dòng)物體表,是一種較為常見的腐生性條件致病菌(Hoeniger,1964),特別容易造成爆發(fā)性的流行,可導(dǎo)致人和畜禽的腹瀉,也可導(dǎo)致食物中毒、敗血癥和化膿性炎癥等。該菌既能水平傳播,又可垂直傳播。近年來(lái),奇異變形桿菌在畜禽生產(chǎn)中引起的疫情數(shù)量呈上升趨勢(shì),水貂、狐貍等多種水貂感染奇異變形桿菌的報(bào)道也頻繁
2、出現(xiàn),以多種內(nèi)臟器官出現(xiàn)出血性敗血癥為主要癥狀特點(diǎn),給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
目前,奇異變形桿菌的檢測(cè)一般采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定的方法,包括細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定、藥敏試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)等。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用,國(guó)外學(xué)者曾對(duì)奇異變形桿菌的PCR檢測(cè)方法做過(guò)相關(guān)研究。本研究采用傳統(tǒng)和PCR檢測(cè)方法分離鑒定菌株,為水貂奇異變形桿菌的快速檢測(cè)奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。
近些年來(lái)的試驗(yàn)表明,外膜蛋白(OMP)作為細(xì)菌
3、細(xì)胞膜中的一種重要組成成分,具有良好的免疫原性,不僅能夠很好地刺激體液免疫,還能夠刺激細(xì)胞免疫作用。朱明華等提取奇異變形桿菌的OMP,將OMP免疫1日齡的雛雞,結(jié)果證明,奇異變形桿菌OMP具有良好的免疫原性與免疫保護(hù)作用(朱明華等,2010)。國(guó)外報(bào)道,奇異變形桿菌的外膜蛋白A作為一種保護(hù)性抗原,能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分裂。本研究通過(guò)構(gòu)建奇異變形桿菌OMPA的原核表達(dá)質(zhì)粒,以獲得OMPA重組蛋白,并證明其具有反應(yīng)原性,為進(jìn)一步研究水貂奇異變
4、形桿菌OMPA免疫保護(hù)作用及其功能、亞單位疫苗的開發(fā)奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。
本研究主要包括以下內(nèi)容:
1.水貂奇異變形桿菌的分離與鑒定
從山東某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)的死亡水貂分離到一株致病菌,通過(guò)細(xì)菌形態(tài)特征及鏡檢、培養(yǎng)特性、生化鑒定、藥敏試驗(yàn)和動(dòng)物致病性試驗(yàn)等傳統(tǒng)方法鑒定。生化鑒定結(jié)果表明,糖類多為陰性,氨基酸類為陰性,符合奇異變形桿菌的生化特性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,本菌對(duì)恩諾沙星、頭孢類等具有高度敏感性,對(duì)青霉素與復(fù)合磺
5、胺等不具有敏感性。致病性試驗(yàn)表明,該菌具有很強(qiáng)的致病性。在分子生物學(xué)檢測(cè)方面,根據(jù)奇異變形桿菌的OMPA基因設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到約1107bp大小的片段,與預(yù)期大小相符,從分子水平證明了其為奇異變形桿菌,為水貂奇異變形桿菌的鑒定及其疾病的診斷和治療提供了依據(jù)。
2.水貂奇異變形桿菌OMPA的克隆及原核表達(dá)
為了克隆與表達(dá)奇異變形桿菌外膜蛋白OMPA基因,并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性進(jìn)行研究,首先采用
6、PCR法擴(kuò)增OMPA基因,將目的片段與pET28a(+)表達(dá)載體連接,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,然后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)該蛋白。SDS-PAGE分析表明,誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白的分子質(zhì)量大小約為45kDa,與預(yù)期的大小相一致,該蛋白以包涵體形式存在。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,該蛋白在45 kDa處與陽(yáng)性血清反應(yīng)呈現(xiàn)出清晰的分子量正確的條帶,表明該蛋白具有反應(yīng)原性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究水貂奇異變形桿菌外
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