基于核酸識別的酶活性生物傳感新方法研究.pdf

1、酶作為一種具有生物催化功能的生物大分子，廣泛存在動植物體內(nèi)，支配著生物體的新陳代謝過程，維持機體正常功能。它不僅與生物的生長發(fā)育、遺傳及神經(jīng)傳導等生命活動息息相關，還與細胞損傷、衰老及各種癌癥等疾病的發(fā)生有關。近幾十年來，酶活性的研究得到越來越多的關注，人們不但探索了生物體內(nèi)各種酶與DNA的作用機理，還研究了一系列測定酶的活性的方法，這為進一步研究酶的相關性能帶來了新的曙光，在生物學上具有重大的意義。生物傳感器的研究作為近年來分析化學的

2、重要課題之一，已經(jīng)得到了廣泛的應用。其中利用DNA分子之間堿基互補配對的特異性而構筑的各類以核酸作為分子識別元件的核酸生物傳感器吸引了人們的關注。由于其具有簡便快速，靈敏度高，穩(wěn)定性強，生物相容性好等優(yōu)點而被廣泛的應用于臨床醫(yī)學、環(huán)境監(jiān)測等領域。本論文主要建立了幾種簡便快速、低成本、靈敏選擇性檢測Argonaute2(Ago2)蛋白的的RNA核酸內(nèi)切酶的活性及尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的新方法。
　　論文總共分為四個部分:

3、
　　1、第一部分首先系統(tǒng)的介紹了生物傳感器的基本結構、檢測原理、分類及應用領域與前景。介紹了DNA生物傳感器的工作原理、類型及應用，并重點介紹了電化學DNA生物傳感器和熒光DNA生物傳感器。然后介紹了納米材料氧化石墨烯(GO)、特殊的DNA二級結構G-四鏈體及核酸切口內(nèi)切酶。最后，簡要的概述了Ago2蛋白的概念及UDG的相關內(nèi)容。
　　2、第二部分基于GO建立了一種新穎的熒光信號放大傳感方法檢測哺乳動物Ago2蛋白的RNA

4、核酸內(nèi)切酶活性。Ago2蛋白能夠與miRNA形成復合物而表現(xiàn)出RNA核酸內(nèi)切酶的活性。充分利用GO所具有的高的熒光猝滅效果及對含有不同堿基數(shù)目的單鏈DNA（ssDNA）的親和力的不同的特性，體系中標記有熒光基團(FAM)的DNA探針分子表現(xiàn)出很弱的背景熒光信號，而當加入Ago2-miRNA復合物后引起目標mRNA的斷裂并且釋放出連接有FAM的短寡核苷酸片段，F(xiàn)AM基團遠離GO表面，使得熒光強度大大增強。而Ago2-miRNA復合物又可從

5、雜交鏈中釋放出來進而引發(fā)下一個循環(huán)切割反應，熒光信號得以放大。該檢測Ago2蛋白RNA核酸內(nèi)切酶活性的檢測方法具有出高靈敏度、新穎簡單、低成本等優(yōu)點，其檢測限為1.7nM。
　　3、第三部分利用亞甲基藍(MB)作為電化學雜交指示劑，基于UDG催化移除尿嘧啶堿基誘導鏈釋放，建立了一種免標記電化學傳感平臺靈敏檢測UDG活性的新方法。利用DNA分子間的雜交識別過程將含有四個尿嘧啶堿基的DNA鏈自組裝到通過電沉積樹枝狀納米金修飾的電極表面

6、，經(jīng)MB嵌插產(chǎn)生電化學信號。當加入UDG后，尿嘧啶堿基被特異性的水解，使得DNA雙螺旋結構解開，并且從電極表面釋放出嵌插在DNA雙螺旋結構中的MB，使得相應的氧化還原電信號顯著降低。實驗結果顯示，該傳感體系對UDG的線性響應范圍為0.025U/mL到2U/mL，檢測限為0.012U/mL。此方法具有高靈敏、高選擇性及低成本等優(yōu)點。另外，該方法首次將電化學檢測技術用于檢測UDG的活性。
　　4、第四部分基于核酸切口內(nèi)切酶輔助信號放大

7、策略，建立了一種免標記均相可視化檢測堿基切除修復酶活性的新方法。以作為模型，引入含有尿嘧啶堿基的發(fā)卡DNA探針1(HP1)和富含有鳥嘌呤(G)堿基DNAzyme序列及切口酶切割序列的發(fā)卡探針2(HP2)。當加入UDG后，水解HP1鏈中的尿嘧啶堿基，引發(fā)后面一系列的反應，并結合切口酶的作用引起循環(huán)反應過程，最終形成大量的具有模擬HRP活性的G-四鏈體-heminDNAzyme，用于催化過氧化氫/ABTS體系產(chǎn)生顏色變化，實現(xiàn)了可視化UDG