基于核酸分子探針熒光傳感蛋白檢測新方法研究.pdf

1、DNA容易受到來自細(xì)胞內(nèi)外的刺激而造成各種損傷，這些損傷會通過增加基因突變的概率、加劇DNA錯誤復(fù)制而威脅基因完整性。T4多核苷酸激酶(PNK)和人類8-oxoG DNA糖基化酶1(hOGG1)能夠分別通過修復(fù)DNA5'-羥基末端和基于堿基切除修復(fù)(BER)過程修復(fù)DNA損傷來維護(hù)基因的完整性。核酸分子探針熒光傳感器由于其設(shè)計簡便、實驗操作簡單、靈敏度高、選擇性好，近年來也獲得了快速持久的發(fā)展。本論文通過巧妙設(shè)計熒光分子探針構(gòu)筑了簡便、

2、新奇的DNA生物傳感器實現(xiàn)對酶的研究。
　　本論文分三個部分:
　　1、基于有效的酶反應(yīng)即PNK催化的發(fā)卡探針(HP)的磷酸化和λexo的裂解反應(yīng)，使得觸發(fā)DNA片段(tDNA)從HP上釋放，進(jìn)而能夠催化雙分子信標(biāo)(bi-MBs)的組裝，導(dǎo)致熒光信號的放大，實現(xiàn)PNK活性的靈敏檢測。PNK的檢測限為1mU mL-1，優(yōu)于或相當(dāng)于已報道的檢測方法。而且，這種方便靈敏的方法同樣能夠從常見的幾種抑制劑中篩選抑制劑的活性。對于多核苷

3、酸激酶活性的靈敏檢測和抑制劑的篩選，提供了一個有前景的平臺，也在生物過程研究、藥物釋放和臨床診斷中顯示出巨大的潛力。
　　2、結(jié)合外切酶反應(yīng)和切口酶輔助的熒光信號放大，構(gòu)筑了一個新型的傳感平臺用于靈敏檢測T4多核苷酸激酶的活性和抑制作用。通過循環(huán)切割DNA熒光探針信號放大，實現(xiàn)靈敏檢測PNK活性，檢測限為0.05mU mL-1。本方法實現(xiàn)在均相溶液中采用簡單、無分離方法檢測。此外，也成功分析了幾種已知激酶抑制劑對PNK的抑制作用。

4、
　　3、基于ExoⅢ輔助自發(fā)信號擴(kuò)增技術(shù)實現(xiàn)了熒光法檢測hOGG1活性。本方法巧妙設(shè)計了兩個發(fā)卡探針（HP1和HP2），當(dāng)加入hOGG1時，HP1在8-oxo-7，8-dihydroguanine(8-oxoG)位點被hOGG1識別切斷，隨后ExoⅢ將HP莖一條鏈水解，釋放觸發(fā)DNA片段(tDNA1)。tDNA1與HP2部分雜交，HP2的3'-末端形成雙鏈引發(fā)ExoⅢ輔助的循環(huán)裂解并釋放出另一端觸發(fā)DNA片段(tDNA2)，tD