核酸探針與光學生物傳感的新方法研究.pdf

1、生物傳感器作為快速靈敏檢測生物分子的工具一直以來都是生命科學和分析化學領域十分關注的課題。光學傳感技術因具有靈敏度高、操作簡便、無需分離、可實現(xiàn)實時測定等優(yōu)點，被廣泛應用于生物分子的檢測，如酶活性、蛋白質、核酸和生物小分子等。此外，核酸探針因其序列多變、識別多樣化、穩(wěn)定等優(yōu)點在生物傳感與生化分析新方法建立方面引起了廣泛的關注。在大量文獻調(diào)研的基礎上，本文結合多種構型的核酸探針和光學分析方法構建了幾種光學生物傳感新方法用于檢測聚核苷酸激酶

2、(PNK)活性，miRNA以及與致病基因相關的DNA序列。與傳統(tǒng)方法比較，所建立的傳感策略操作簡便，靈敏度高，檢測成本低，可實現(xiàn)實時測定。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴通過實時監(jiān)測依賴于磷酸化的DNA連接反應，我們構建了一種無標記的生物發(fā)光傳感器用于PNK活性的檢測。在該傳感策略中，設計了兩個帶有5’突出端的發(fā)夾 DNA探針作為磷酸化受體，同時廣泛應用的磷酸供體ATP被dCTP取代。當不存在PNK時，由于發(fā)夾探針5’端缺乏磷酸基團而

3、不能引發(fā)連接反應，顯示出較弱的背景信號。加入PNK時，使兩探針發(fā)生磷酸化而引發(fā)連接反應，同時釋放出 AMP，隨后將 AMP轉換為 ATP，在熒光素酶作用下產(chǎn)生明顯的生物發(fā)光信號，通過生物發(fā)光信號的連續(xù)監(jiān)測可實現(xiàn)PNK活性的實時檢測。該檢測方法操作簡便，無需標記，成本低廉，免受生物基質自身熒光的干擾，還可以進一步用于PNK的定量、動力學及抑制劑研究。⑵基于目標分子引發(fā)雜交鏈式反應(HCR)輔助的連接反應，通過生物發(fā)光法檢測連接反應釋放出的

4、AMP，發(fā)展了一種新的高靈敏的miRNA均相檢測方法。當存在靶miRNA時，它可有效的引發(fā)兩發(fā)夾探針之間的HCR，形成帶有切口的長鏈DNA聚合物，這些切口可被連接酶共價連接，釋放出AMP產(chǎn)生發(fā)光信號，從而實現(xiàn)miRNA的定量分析。HCR的引入不僅提高了檢測的靈敏度，而且通過核酸探針的特殊設計可為其它生物分子的檢測提供潛在平臺。重要的是，生物發(fā)光實驗以靶依賴連接副產(chǎn)物AMP轉換的ATP作為報告基團，無需復雜的熒光素酶標記、固定、分離等步驟

5、。該方法具有操作簡單，成本低廉，高通量，高靈敏等優(yōu)點，在實際檢測中有很大的應用價值。⑶將納米金的重力和聚合酶的識別作用相結合，構建了一種簡單的熒光傳感方法用于靶DNA序列檢測，并選用與致病基因相關的p53序列為模型。首先，將巰基修飾的引物通過S-Au自組裝到AuNP上，當存在目標DNA時，探針與目標DNA的部分序列雜交，生成的不對稱產(chǎn)物在Taq DNA聚合酶和dNTPs的輔助下，延伸形成穩(wěn)定的dsDNA螺旋結構。最后，在連接酶的作用下將