1,3-丙二醇氧化還原酶及其同工酶生物磚元件與酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、1，3-丙二醇是一種應(yīng)用廣泛的重要化工原料。利用甘油生物法合成1，3-丙二醇具有原料可再生、過程環(huán)境友好等特點(diǎn)，具有廣闊的發(fā)展前景。這一生物轉(zhuǎn)化過程中，一部分甘油經(jīng)歷氧化路徑轉(zhuǎn)化成二羥基丙酮(DHA)并釋放還原力輔酶NADH;另一部分甘油經(jīng)歷還原路徑，先脫水生成3-羥基丙醛，再進(jìn)一步被1，3-丙二醇氧化還原酶還原成目標(biāo)產(chǎn)物1，3-丙二醇，并伴隨著消耗氧化途徑生成的還原力NADH。目前，單一輔酶無法為甘油還原路徑提供足夠的還原力，雖然聯(lián)合

2、利用兩種輔酶可以提高最終的生產(chǎn)效果，但其中的重要科學(xué)問題——這兩種輔酶的并用機(jī)制還不清晰。為此，本文利用新興的合成生物學(xué)方法，通過設(shè)計(jì)生物磚元件及生物系統(tǒng)來調(diào)控基于兩種輔酶的1，3-丙二醇氧化還原酶及其同工酶的表達(dá)，以便對(duì)輔酶并用的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行分析和建模，為構(gòu)建更優(yōu)的1，3-丙二醇生物合成體系奠定基礎(chǔ)。
　　本文構(gòu)建了編碼基因分別為dhaT基因和yqhD基因的兩類生物磚元件，可相應(yīng)地表達(dá)出依賴于輔酶NADH和NADPH的1，3-丙

3、二醇氧化還原酶(PDOR)及其同工酶(YQHD)。在此基礎(chǔ)上，研究了不同生物磚元件的表達(dá)效率，并對(duì)1，3-丙二醇氧化還原酶表達(dá)最優(yōu)培養(yǎng)條件和酶活性質(zhì)進(jìn)行探討。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　一、構(gòu)建了分別編碼PDOR及YQHD的基因dhaT和yqhD的生物磚元件庫。dhaT與yqhD基因分別源自Klebsiellapneumoniae和E.coli，通過PCR擴(kuò)增，并將其標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)生物磚標(biāo)準(zhǔn)組裝方法依次將核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS，

4、啟動(dòng)子T7promoter，終止子TTterminator與目的基因dhaT和yqhD連接，構(gòu)建成具有不同表達(dá)效率(RBS1.0、RBS0.6、RBS0.3、RBS0.07)的生物磚1，3-丙二醇氧化還原酶及其同工酶庫。
　　二、考察了pSB1A2-T7-RBS-dhaT-TT合成表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)條件。首先對(duì)破碎條件進(jìn)行摸索，最適破碎條件是175W，破碎時(shí)間3s，間歇時(shí)間3s。然后對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)溫度，IPTG用量進(jìn)行考察，最優(yōu)誘導(dǎo)

5、條件為IPTG0.1mM、30℃、150rpm誘導(dǎo)10h。與優(yōu)化前的酶活力相比，基于RBS1.0的酶活力顯著提高，粗酶活由52U/ml提高到211U/ml，比活由12.1U/mg提高到40.3U/mg，高于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道值。而基于其他RBS(RBS0.6、RBS0.3、RBS0.07)優(yōu)化后也比優(yōu)化前的酶活提高了2倍左右。
　　三、考察了PDOR無細(xì)胞抽提液的酶學(xué)性質(zhì)。該酶的最適宜環(huán)境為45℃，pH11.0，且該酶在此條件下具備一定

6、穩(wěn)定性?？疾彀l(fā)現(xiàn)離子強(qiáng)度對(duì)酶活影響較大，Mn2+對(duì)酶有極強(qiáng)的激活作用;Na+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+對(duì)酶活力有一定的抑制作用;Cu2+、Zn2+則對(duì)酶活力有完全抑制作用;而鉀離子強(qiáng)度在低于1.0mol/L時(shí)有激活作用，在高于1.0mol/L時(shí)有抑制作用。該酶對(duì)底物的選擇性很強(qiáng)，只對(duì)1，3-丙二醇表現(xiàn)出活性。1，3-丙二醇氧化還原酶以1，3-丙二醇和NAD+為底物的米氏常數(shù)分別為28.5mmol/L和2.62mm