氧化還原酶-鹵代醇脫鹵酶多酶法合成手性β-羥基腈.pdf

1、多酶法生物合成被稱為第三代生物催化，包括體外的多酶法和體內(nèi)的多酶法。它已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于手性化學(xué)品的不對稱合成，包括級聯(lián)反應(yīng)和偶聯(lián)反應(yīng)，如輔酶的原位再生等。手性β-羥基腈是醫(yī)藥與化工行業(yè)中的重要中間體。目前，用于制備手性β-羥基腈的生物催化方法主要有兩種:動力學(xué)拆分和不對稱合成。其中，采用氧化還原酶-鹵代醇脫鹵酶多酶法催化的級聯(lián)反應(yīng)，能以價格相對便宜的潛手性的鹵代酮為出發(fā)底物，不對稱合成手性β-羥基腈，理論轉(zhuǎn)化率可達到100％，具有明顯的

2、優(yōu)勢。然而，目前這方面的研究都是在體外進行的。由于不同酶的適宜催化條件不同，致使該工藝的轉(zhuǎn)化效率不高。另外，體外的多酶法催化需要人為添加昂貴的輔因子，如NAD(P)+等，增加了反應(yīng)的成本，且需要對各個酶分別表達和純化，過程也較麻煩。
　　由于體內(nèi)的多酶法不需要分別表達和純化酶蛋白，且容易實現(xiàn)輔酶的原位再生，既能簡化操作過程，也能降低反應(yīng)成本。而且，細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)內(nèi)環(huán)境還有利于酶的穩(wěn)定，使不同的酶能在同一個細(xì)胞內(nèi)更好地發(fā)揮功能。因此，采

3、用體內(nèi)的多酶法，能夠彌補體外多酶法的不足，進一步提高生物催化級聯(lián)反應(yīng)或偶聯(lián)反應(yīng)的效率。本文通過氧化還原酶和鹵代醇脫鹵酶在Escherichia coli中的共表達，首次使用一菌多酶法，以鹵代酮為出發(fā)底物，制備手性β-羥基腈。該方法操作方便，底物較便宜，轉(zhuǎn)化率可達100％，部分產(chǎn)物ee值大于99％。并通過引入輔酶再生酶和多酶共表達策略的優(yōu)化，實現(xiàn)了輔酶NADPH和NADH的高效原位再生，并使Eco_RBH多酶體系中各酶的活力達到平衡，有效

4、提高了多酶體系的催化效率。同時，首次揭示了鹵代醇脫鹵酶HHDH活力受COBE（4-氯乙酰乙酸乙酯）抑制的機理:COBE與HHDH活性中心的Ser132和Tyr145結(jié)合，占據(jù)了該酶的催化活性位點。該抑制作用為競爭性可逆抑制?；谝陨弦种茩C理，通過突變篩選，獲得了陽性突變株F136V/W249F，其COBE半抑制濃度是HHDH(wild-type)酶的20倍。另外，首次以6-氯3，5-二羰基己酸叔丁酯為底物，經(jīng)過三步酶促反應(yīng)，合成了阿托伐

5、他汀的關(guān)鍵中間體——(3R，5R)6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯。
　　一、利用源于Lactobacillus kefiri DSM20587的醇脫氫酶AdhR和AdhS具備的不同選擇性，結(jié)合源于Agrobacterium radiobacterAD1的鹵代醇脫鹵酶HheC，構(gòu)建了兩個氧化還原酶-鹵代醇脫鹵酶組合的一菌雙酶體系A(chǔ)dhR-HheC和AdhS-HheC，并以4-氯乙酰乙酸乙酯為模型底物，一鍋法制備了手性的4-氰基-

6、3-羥基丁酸乙酯(HN)。兩個體系具有相反的選擇性。
　　在此基礎(chǔ)上，通過研究AdhR和AdhS的輔酶再生，引入葡萄糖脫氫酶GdhBS和甲酸脫氫酶FdhCB，按照不同共表達策略（單質(zhì)粒或雙質(zhì)粒），分別建立了兩個一菌多酶體系A(chǔ)dhR-GdhBS-HheC和AdhS-FdhCB-HheC，并實現(xiàn)了多酶的均衡表達。與一菌雙酶體系相比，一菌多酶體系的羰基還原活力得到了提高。再利用催化活力較高的鹵代醇脫鹵酶HHDH(F136V/W249F)

7、替換兩個一菌多酶體系中的HheC，提高了脫鹵氰化的反應(yīng)活力，構(gòu)建了工程菌Eco_RBH和Eco_SFH。前者催化COBE底物到(R)-HN的級聯(lián)反應(yīng)，第一步反應(yīng)活力195 U/L，第二步反應(yīng)活力184 U/L;后者催化COBE底物到(R)-HN的級聯(lián)反應(yīng)，第一步反應(yīng)活力18.1 U/L，第二步反應(yīng)活力107 U/L。考察了工程菌Eco_RBH和Eco_SFH的4℃儲藏穩(wěn)定性，37℃操作穩(wěn)定性及重復(fù)利用穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)一菌多酶的全細(xì)胞體系比粗

8、酶液體系具有更好的穩(wěn)定性，且可以被重復(fù)利用。
　　分析了HheC、HHDH、AdhR和AdhS酶的底物譜。在此基礎(chǔ)上，利用一菌多酶體系Eco_ RBH成功制備兩個手性β-羥基腈產(chǎn)品:(R）-HN和(S)-3-羥基苯丙腈。兩者ee值都大于99％。利用一菌多酶體系Eco_ SFH成功制備兩個手性β-羥基腈產(chǎn)品:(S)-HN和(R）-3-羥基苯丙腈。前者ee值為60.2％，前者ee值為93.2％。
　　二、克隆表達了鹵代醇脫鹵酶H

9、HDH。測得該酶催化(S)4-氯-3-羥基丁酸乙酯((S)-CHBE)反應(yīng)的比活力為3408 U/g，催化(R)-CHBE反應(yīng)的比活力為3712 U/g。發(fā)現(xiàn)HHDH受COBE活力抑制嚴(yán)重，COBE對HHDH的半抑制濃度約為10μM。進而研究了HHDH受COBE活力抑制動力學(xué)。結(jié)果表明，該抑制作用是競爭性的可逆抑制。通過分子模擬分析和計算，揭示了COBE抑制HHDH的機理:COBE分子能結(jié)合到HHDH的活性中心，并與Ser132和Tyr

10、145形成氫鍵，阻礙反應(yīng)底物與酶催化殘基的結(jié)合。結(jié)合能計算結(jié)果也表明，COBE與HHDH的結(jié)合能力較強，超過了反應(yīng)底物(S)-CHBE。
　　通過在HHDH活性中心附近和底物通道入口處的氨基酸，分別進行飽和定點突變。篩選得到兩個陽性突變體W249L和F136L。在249位和136位氨基酸同時引入飽和定點突變，篩選得到了一個陽性突變體F136V/W249F。 COBE對突變體F136V/W249F的半抑制濃度約為200μM，是HHD

11、H(wild-type)的20倍。
　　三、在搖瓶中對工程菌Eco_RBH的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，使用工業(yè)級的培養(yǎng)基替換了LB培養(yǎng)基。利用工業(yè)級培養(yǎng)基，在搖瓶中對工程菌Eco_RBH的發(fā)酵表達條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后工程菌Eco_RBH的第一步反應(yīng)活力為857.9 U/L，同時第二步反應(yīng)活力為932.3 U/L，約為LB培養(yǎng)基中催化活力的4倍。然后，研究了工程菌Eco_RBH在15L發(fā)酵罐上的高密度發(fā)酵工藝。通過補料分批發(fā)酵，使菌體

12、干重達到20.44 g/L，第一步反應(yīng)活力為8620 U/L，第二步反應(yīng)活力為8587 U/L，約為搖瓶培養(yǎng)最佳催化活力的10倍。
　　研究了工程菌Eco_RBH催化反應(yīng)時，溫度和pH值等因素的影響。結(jié)果表明，最佳的反應(yīng)溫度為30℃，最佳的反應(yīng)pH值為7.0。研究了工程菌Eco_ RBH在提高底物濃度時的催化反應(yīng)。以高密度發(fā)酵所得Eco_RBH菌體為催化劑（細(xì)胞負(fù)載量為20 g干細(xì)胞/L），投入100 mM的COBE反應(yīng)，2h后可

13、以被完全轉(zhuǎn)化為(R)-HN。而投入100 mM的2-氯苯乙酮反應(yīng)，1h后可以被完全轉(zhuǎn)化為(S)-3-羥基苯丙腈。
　　四、利用工程菌BL21_pACYCDuet-AdhR，以6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯為底物，合成了（S)-6-氯-5-羥基-3羰基己酸叔丁酯。產(chǎn)物ee值大于99％。催化活力約為12U/L。利用源于Candidia magnoliae的羰基還原酶Cr和葡萄糖脫氫酶GdhBS，構(gòu)建工程菌BL21_pACYCDuet

14、-CB，以(S)-6-氯-5-羥基-3羰基己酸叔丁酯為底物，合成了(3R,5S)6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯。產(chǎn)物de值約98.2％。催化活力約為35 U/L。
　　利用AdhR、Cr和GdhBS，構(gòu)建了工程菌Eco_RCB，并成功用于以6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯為底物，制備他汀類藥物的關(guān)鍵中間體(3R,5S)6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯的反應(yīng)，催化活力約為11 U/L。利用鹵代醇脫鹵酶HHDH，構(gòu)建了工程菌Eco