卵白蛋白源抗氧化活性肽的酶法制備及分離鑒定.pdf

1、卵白蛋白具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)又是一種過敏原，經(jīng)酶水解后可獲得具有多種生理功能的生物活性肽。本課題主要研究了卵白蛋白抗氧化肽的酶法制備及分離鑒定，包括蛋清源卵白蛋白的提取，兩種不同蛋白酶酶解卵白蛋白獲得抗氧化活性肽的最佳工藝和抗氧化活性肽的分離與鑒定。
　　以雞蛋清為原料，采用半飽和硫酸銨法對蛋清液進(jìn)行鹽析，使卵白蛋白沉降。再經(jīng)過兩步超濾，以除去卵白蛋白中摻雜的卵粘蛋白和溶酶菌。將提取出的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定，

2、結(jié)果顯示提取物為卵白蛋白。
　　采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶分別水解卵白蛋白粉，進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度對酶解物抗氧化活性和水解度的影響，并通過正交試驗(yàn)L4(23)和L9(34)對酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，抗氧化活性的測定指標(biāo)是DPPH自由基清除能力。最終得到:(1)胃蛋白酶水解卵白蛋白的抗氧化活性研究中，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對DPPH自由基清除率和水解度的影響最大;(2)實(shí)驗(yàn)得出胃蛋白酶水解卵白蛋白制備抗氧化活

3、性肽的最佳工藝條件:底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4％、酶解時(shí)間5h、加酶量9000U/g。此時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到89.16％、水解度為82.71％;(3)堿性蛋白酶酶解卵白蛋白的抗氧化活性研究中，酶解時(shí)間對DPPH自由基清除率的影響最大，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解度的影響最大;(4)實(shí)驗(yàn)得出堿性蛋白酶水解卵白蛋白制備抗氧化活性肽的最佳工藝條件:底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4％、酶解時(shí)間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃。此時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到96.92％、

4、水解度為57.14％，可見堿性蛋白酶酶解卵白蛋白的酶解物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。(5)對比兩種酶最佳工藝條件下水解物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶水解物的抗氧化活性較強(qiáng)，因此最終選定堿性蛋白酶來酶解卵白蛋白并進(jìn)行后續(xù)研究。
　　對堿性蛋白酶水解卵白蛋白最佳工藝條件下的酶解物進(jìn)行超濾。超濾得到相對分子量為:＞30KDa、10-30KDa、5-10KDa、＜5KDa這四個(gè)抗氧化肽。測定四個(gè)抗氧化肽的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)分子量不同的卵白蛋白抗氧化

5、肽表現(xiàn)出的抗氧化活性不盡相同，DPPH自由基清除率和超氧陰離子清除率與抗氧化肽的分子量并沒有特定的規(guī)律。其中＜5KDa的抗氧化肽抗氧化活性最好，DPPH自由基清除率達(dá)92.57％，超氧陰離子清除率達(dá)到75.83％。＜5KDa的抗氧化肽經(jīng)高效反液相色譜鑒定得到三個(gè)主峰，又經(jīng)過MALDIESI/MS一級質(zhì)譜測定主肽段相對分子量為559.72、583.55、841.68。
　　本課題從雞蛋清中提取出了卵白蛋白，并優(yōu)化了胃蛋白酶和堿性蛋白