苜蓿葉蛋白和酶法制備抗氧化肽的研究.pdf

1、苜蓿葉蛋白是以苜蓿葉為原料，經(jīng)壓榨取汁、汁液中蛋白質(zhì)分離和濃縮干燥而制備的蛋白質(zhì)濃縮物(Alfalfa Leaf Protein Concentration，簡稱ALPC)。苜蓿葉蛋白屬“功能性蛋白質(zhì)”，主要由葉綠體內(nèi)基質(zhì)蛋白和細胞質(zhì)內(nèi)溶解性良好的細胞質(zhì)蛋白等組成。被聯(lián)合國糧農(nóng)組織( FAO)認為是一種具有高開發(fā)價值的新型蛋白質(zhì)資源。
　　 但目前國內(nèi)外對苜蓿葉蛋白的研究與開發(fā)主要集中于蛋白質(zhì)的提取和利用。但對其蛋白質(zhì)的功能機理

2、及其水解后的蛋白肽和氨基酸組成研究甚少，特別是水解肽的生物活性研究更是鮮見報道。因此利用苜蓿葉蛋白研究和開發(fā)具有某種功能的生物活性肽，就具有較好的理論研究和一定的現(xiàn)實意義。
　　 本論文首先以不使蛋白質(zhì)變性為前提，采用堿提酸沉的基本路線，以壓塊苜蓿為材料，通過不同的加水量、調(diào)節(jié)pH值、浸泡時間等處理以尋求最佳的提取可溶性苜蓿葉蛋白濃縮物(Soluble Alfalfa Leaf Protein Concentration，簡稱S

3、ALPC)的工藝與參數(shù)。得到的最優(yōu)提取條件為：料液比為1：7(w/w)，堿提pH為9.0，浸泡時間為50min，酸沉pH為4.0。影響蛋白提取率的因素主次順序為：酸沉pH>堿提pH>浸泡時間>料液比。用優(yōu)化后的工藝參數(shù)提取SALPC，其提取率為57.87%，蛋白質(zhì)含量高達87.38%，明顯高于資料報道的其它提取方法50%-65%的得率。SALPC在pH值6～10范圍內(nèi)有較好的氮溶解指數(shù)NSI，最大值為77.32%。
　　 其次以

4、體外抗氧化活性及水解度DH為考察指標，研究了SALPC的酶解工藝，從5種商品蛋白酶中確定了最適水解酶為堿性蛋白酶Alcalase FG2.4L。通過單因素試驗確定其水解SALPC的較適宜的條件為：水解溫度60℃，pH值為8.0，SALPC的底物濃度為5%(w/v)，[E]/[S]為4.0%(W/W)。酶解后的苜蓿葉蛋白水解物(Alfalfa Leaf Protein Hydrolysate，簡稱ALPHs)相對分子質(zhì)量主要分布在5000

5、以下，其中相對分子質(zhì)量小于3000的組分比例為93.03%，小于1000的組分比例為67.86%，對DPPH·有較好的清除率。
　　 盡管通過酶解工藝的優(yōu)化而獲得分子質(zhì)量相對較為集中、生物活性較強的組分，但蛋白質(zhì)酶解液的成分仍然復(fù)雜多樣，有必要對ALPHs進行超濾分離。其次在堿提酸沉法和水解過程中產(chǎn)生了一些鹽分，這些鹽分可能會干擾ALPHs生理活性的分析和作用。因此有必要研究大孔吸附樹脂對ALPHs的吸附性能和脫鹽效果。結(jié)果表明

6、：采用相對分子質(zhì)量為3000的聚砜膜對ALPHs進行超濾分離的最適工藝條件為：操作壓力0.35 MPa，操作溫度25℃，ALPHs濃度35 g/L，超濾后的ALPHs中相對分子質(zhì)量1000～500的組分含量由21.85%提高到27.91%，500～130的組分含量由21.64%提高到30.83%，130以下的組分含量從4.91%提高到7.61%。并且疏水性氨基酸的質(zhì)量百分比從32.00%提高到33.98%。這些疏水性氨基酸的增加使得超濾

7、后的ALPHs在各個濃度上對DPPH·清除率都有所提高。DA201-C大孔吸附樹脂對ALPHs的靜態(tài)吸附與解吸的效果優(yōu)于其它4種樹脂。動態(tài)吸附解吸試驗表明：ALPHs以50 mg/mL、0.5 BV/h流速上樣、1 BV/h的流速水洗、1.5 mL/min的75%的乙醇解吸，ALPHs的脫鹽率為92.21%，處理后ALPHs中疏水性氨基酸的質(zhì)量百分比從33.98%提高至36.69%，脫鹽后ALPHs在各個濃度上對DPPH·清除率都有所提

8、高。
　　 ALPHs在6種體外抗氧化模型中均表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，且有較顯著的量效關(guān)系。這說明ALPHs是良好的電子供體和氫供體，能明顯抑制亞油酸體系的過氧化作用，具有清除O2-·、·OH及DPPH·能力，對金屬Fe2+具有較好的螯合作用。其清除自由基的機制可能是通過肽類對過渡金屬離子的螯合來實現(xiàn)的；當ALPHs的濃度為GSH的3～5倍時，可達到與GSH相當?shù)目寡趸省?br>　　 小鼠體內(nèi)抗氧化試驗的結(jié)果表明，ALPH

9、s能顯著降低小鼠體內(nèi)MDA的含量(p<0.01)，顯著提高血清和心臟，特別是肝臟組織中SOD和GSH-Px的活性(p<0.01)，充分說明ALPHs對小鼠具有較好的抗氧化作用。
　　 利用Sephadex G-15凝膠色譜將ALPHs分成了4個組分A、B、C和D。并分別檢測了各組分的還原能力和對不同自由基的捕獲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組分ALPHs-D為抗氧化活性最高的組分，其余三組分的抗氧化能力依次為B>C>A。利用半制備RP-HPLC