基于rDNA ITS序列分析的石斛屬種內(nèi)及種間鑒別.pdf

1、分類(lèi)號(hào)R931.5學(xué)校代號(hào)10572UDC610密級(jí)學(xué)號(hào)091100090廣州中醫(yī)藥大學(xué)GuangzhouUniversityofChineseMedicineGuangzhouUniversityofChineseMedicine碩士學(xué)位論文基于rDNA基于rDNAITSITS序列分析的石斛屬序列分析的石斛屬種內(nèi)及種間鑒別種內(nèi)及種間鑒別學(xué)位申請(qǐng)人李海霞李海霞指導(dǎo)教師姓名黃海波副教授黃海波副教授專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)生藥學(xué)生藥學(xué)申請(qǐng)學(xué)位類(lèi)型科學(xué)學(xué)位科

2、學(xué)學(xué)位論文提交日期2012年4月2012年4月摘要石斛類(lèi)藥材應(yīng)用歷史悠久，具有滋陰清熱、潤(rùn)肺止咳、生津益胃等功效。在《神農(nóng)本草經(jīng)》當(dāng)中被列為“上品”藥材，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。多年來(lái)由于對(duì)石斛資源的需求量巨大，許多地方均開(kāi)展了對(duì)石斛進(jìn)行大規(guī)模人工栽培的研究。鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuretMigo）具有增強(qiáng)免疫力、降低血糖、抗衰老、抗腫瘤等活性，可用于胃腸道、白內(nèi)障、關(guān)節(jié)炎和慢性咽炎等疾病的治療，在癌癥放化

3、療患者的康復(fù)治療中應(yīng)用廣泛。在石斛新品種選育及資源開(kāi)發(fā)研究中，對(duì)物種身份進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定極為重要。由于商品石斛種類(lèi)繁多、基源復(fù)雜藥材在加工炮制過(guò)程中，形態(tài)、性狀會(huì)發(fā)生變化導(dǎo)致傳統(tǒng)的以形態(tài)學(xué)為主的鑒定方法在實(shí)際應(yīng)用中顯得捉襟見(jiàn)肘?；诤怂嵝蛄蟹治龅腄NA條形碼技術(shù)的出現(xiàn)，為快速準(zhǔn)確地鑒定樣品物種的身份帶來(lái)了希望。位于核基因具有多拷貝的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（InternaltranscribedspacerITS）已廣泛用于種內(nèi)和種間親緣關(guān)系分析。I

4、TS區(qū)依次包括ITS1、5.8S、ITS2，位于其兩端的18S和26S因較為保守，通常以之為模板設(shè)計(jì)引物，對(duì)ITS進(jìn)行擴(kuò)增。目的：通過(guò)對(duì)野生鐵皮石斛樣品的4段候選序列（葉綠體基因psbAtrnH、matK、rbcL；核ITS序列）進(jìn)行篩選，用篩選出來(lái)的序列結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中所有已知的代表性的同源序列進(jìn)行多重序列比對(duì)和親緣關(guān)系分析，同時(shí)通過(guò)尋找特異性的堿基變異位點(diǎn)，從種內(nèi)和種間2個(gè)層面，探討利用DNA序列分析方法推測(cè)鐵皮石斛產(chǎn)地可

5、行性及石斛屬植物分組鑒別的可行性。為鐵皮石斛優(yōu)良品種選育和引種馴化提供理論依據(jù)。方法：一、DNA測(cè)序方法：將所有植物材料用無(wú)菌水沖洗干凈，晾干剪碎后用硅膠干燥，各稱(chēng)取0.05g，經(jīng)液氮研磨后，用天根DP305離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒提取總基因組DNA。利用引物對(duì)上述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取3LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)，經(jīng)Wizard試劑盒純化后送是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雙向測(cè)序。二、數(shù)據(jù)分析方