赤水金釵石斛rDNA ITS序列分析.pdf

1、目的：本實驗運用PCR直接測序法和克隆測序法，對赤水金釵石斛(Ddendrobiumnobile)rDNA(核糖體DNA)ITS區(qū)(內轉錄間隔區(qū))進行序列測定與分析，探討赤水金釵石斛在ITS片段上的遺傳特征，以期提高赤水金釵石斛在分子水平的鑒定標準。 方法：(1)應用改良CTAB法提取50株赤水金釵石斛的總DNA。(2)利用石斛屬特異引物，對赤水金釵石斛ITS序列擴增。(3)凝膠回收試劑盒回收純化ITS序列，并送公司測序。(4)

2、以回收純化的ITS序列作為目的基因，PMD18-T為載體，作T-A克隆，通用引物作為測序引物。(5)用ClustalX1.83軟件對測序結果進行對位排列，并用MEGA3.1對所得測序結果進行系統(tǒng)發(fā)生分析。 結果：(1)改良CTAB法提取的金釵石斛基因組DNA分子量約23kb，電泳條帶無拖尾，紫外檢測OD<,260/280>比值是1.52～1.75，符合PCR模板的要求。(2)PCR所得ITS序列約為750bp，電泳條帶清楚單一。

3、(3)回收純化所得金釵石斛ITS序列紫外檢測OD<,260/280>大于1.7，電泳條帶清晰，與Marker對照在6mm點樣孔中含量可達100ng以上。公司直接測序結果為700～750bp.(4)載體與目的基因連接后，提取所得的重組質粒電泳條帶約在3000bp處；再通過質粒PCR，菌落PCR做鑒定，發(fā)現(xiàn)其電泳條帶均在750bp處，克隆測序結果為750～800bp，說明克隆成功。(5)直接、克隆測序結果：赤水基地栽種金釵石斛ITS序乒列(

4、包括ITS1，IFS2與5.8S)完全一致；野生金釵石斛樣品ITS序列一致。通過與Genbank登錄的金釵石斛ITS對照，ITS1與ITS2序列的起止范圍分別為1～23lbp和395～636 bp。我們實驗發(fā)現(xiàn)在金釵石斛種內群體之間ITS區(qū)中，ITS2和編碼5.8SrRNA基因區(qū)的序列完全相同，而在ITS1區(qū)存在堿基差異。實驗證實：克隆測序與直接測序結果基本一致，僅有一株赤水金釵石斛栽種株(編號11F07j027296(3)PF)在12

5、位為A，可能為細菌擴增過程中產生了基因突變。測序結果提交Genbank，序列號為：EF618732。(6)根據ITS序列特征以鄰接法構建了系統(tǒng)樹，在遺傳距離0.0005處，可將七個不同地區(qū)的金釵石斛分為六個聚類群，其中云南麗江和海南金釵石斛聚在一枝，赤水金釵石斛栽種株和野生株聚在一枝。 結論：金釵石斛ITS1序列基因多態(tài)性比ITS2序列更顯著；本試驗結果為赤水金釵石斛提供了新的分子依據；也為金釵石斛的物種鑒定補充了新的遺傳數(shù)據。