RAPD標記技術及rDNA ITS序列分析對蒲公英的應用研究.pdf

1、目的：研究河南蒲公英屬植物的親緣關系與遺傳多樣性,為蒲公英屬植物的品種鑒別、分類、優(yōu)良品種的選育及其品質評價提供分子依據(jù)。
　　方法：(1)分別采用改良的CTAB、SDS、高鹽低pH三種提取方法及液氮、玻璃砂兩種研磨方法提取蒲公英基因組總DNA,通過紫外吸收、電泳檢測和PCR擴增檢測所得DNA的純度和濃度。(2)以提取出的基因組總DNA為模板,對蒲公英RAPD-PCR反應體系中各個主要的影響因子進行優(yōu)化和篩選。(3)利用RAPD分

2、子標記技術和方法對不同居群蒲公英進行檢測,通過計算遺傳相似系數(shù)并建立其聚類分析圖。(4)提取不同產地的蒲公英基因組總DNA,以核糖體基因組ITS通用引物為引物進行擴增,擴增產物經純化后,用PCR產物直接測序法進行測序。
　　結果：(1)不同提取方法所得到得DNA純度和濃度存在顯著差異,以改良的CTAB法提取效果最好,純度最高,電泳結果顯示主條帶最清晰,降解較少。兩種研磨方法所得結果相近。(2)建立了多態(tài)性高、重復性好,可用于蒲公英

3、RAPD分析的最佳反應體系。25μl反應體系中含有:1×TaqMixbuffer、50ngDNA模板、0.4μmol/L引物、1.5mmol/LMg2+、0.25mmol/LdNTPs、1.25UTaq酶。擴增程序為:94℃預變性5min;94℃變性1min,38℃復性1min,72℃延伸2min,共40個循環(huán);72℃延伸10min,反應結束后,4℃保存。(3)從150條隨機引物篩選出10條有效引物,在河南4個品種24個野生蒲公英居群R

4、APD共擴增出1110個位點,平均每個引物擴增出111個位點,每個居群擴增出46.25個位點;在所獲得的95條可重現(xiàn)譜帶中,7條單態(tài),88條多態(tài),多態(tài)性程度達92.63％,遺傳距離在0.0087-0.7922。(4)蒲公英屬植物ITS序列總長度約為641-642bp,其中ITS1長度為255-256bp,5.8S長度為162bp,ITS2長度為224bp。序列間共有23個變異位點。運用DNAStar軟件進行系統(tǒng)分析得到蒲公英屬內4種植物

5、的系統(tǒng)進化樹,這一分析結果與來自形態(tài)學的研究結果基本吻合。
　　結論：(1)改良的CTAB法適合于蒲公英基因組總DNA的提取。(2)優(yōu)化出的PCR反應體系為今后利用RAPD分子標記技術進行蒲公英鑒定及種質資源遺傳多樣性分析奠定了基礎。(3)蒲公英不同種、同一種不同居群間存在明顯的遺傳分化,其中種間差異大于種內,遺傳多樣性主要存在于居群間;RAPD技術可以作為蒲公英居群遺傳多態(tài)性、親緣關系及品種鑒別研究的有效手段。(4)rDNAIT