雞蛋孵化早期蛋清抗微生物特點(diǎn)及其作用機(jī)制.pdf

1、雞蛋蛋清具有獨(dú)特的物理特性和豐富的化學(xué)因子，有可能在防止微生物感染、保證卵黃內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)免受破壞、保持胚胎活性等方面發(fā)揮重要作用。本研究以孵化早期雞胚蛋蛋清為研究對(duì)象，深入挖掘孵化蛋清抗菌特性及其作用機(jī)制，旨在揭示蛋清抗菌因子在孵化條件下的作用特點(diǎn)及相互作用關(guān)系。主要開(kāi)展以下三個(gè)方面的研究：(1)孵化早期蛋清抗菌防御體系變化及其對(duì)雞蛋蛋清抗菌功能的影響；(2)孵化早期蛋清抗微生物防御作用機(jī)制研究；(3)蛋清蛋白質(zhì)抗菌相互作用關(guān)系研究。具體

2、研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 研究測(cè)定了孵化早期蛋清基本理化性質(zhì)及體外抗菌活性的變化。結(jié)果表明，蛋清pH值在孵化約48 h后上升至最高值，而蛋白高度下降到最低值；之后，蛋清pH值開(kāi)始降低，蛋清開(kāi)始濃縮，濃蛋清及稀蛋清粘度均快速上升。孵化早期蛋清的理化性質(zhì)的變化直接影響蛋清的體外抗菌功能。孵化第2d胚蛋蛋清抗菌功能明顯增強(qiáng)，尤其是抑制革蘭氏陰性菌腸炎沙門(mén)氏菌的作用。孵化2d后，隨孵化時(shí)間的延長(zhǎng)，胚蛋蛋清的抑菌功能明顯減弱，到孵化第5

3、d時(shí)，胚蛋蛋清抑制革蘭氏陰性菌的作用能力幾乎消失。
　　 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶是蛋清內(nèi)含量最豐富的兩種抗菌功能性蛋白質(zhì)。研究通過(guò)SDS-PAGE和RP-HPLC技術(shù)對(duì)不同孵化階段蛋清內(nèi)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶含量及活性變化進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，隨著孵化時(shí)間的延長(zhǎng)，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度不斷增加，而溶菌酶的濃度變化很小。表明溶菌酶在禽蛋孵化早期可能存在一定程度上的降解。蛋清總鐵結(jié)合力不斷增強(qiáng)，在孵化第5d時(shí)，達(dá)到最高值23.78±0.65 mg

4、/mL。蛋清溶壁活性在孵化0d時(shí)約為30397±2280 U/mg，孵化2天后降至15036±2574 U/mg。隨后，蛋清溶壁活性開(kāi)始緩慢增加，這種變化可能與孵化蛋清內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的pH有關(guān)。
　　 研究采用凝膠層析結(jié)合MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)孵化早期蛋清內(nèi)小分子量(LMW)蛋白質(zhì)(肽)組成變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而揭示孵化早期蛋清蛋白質(zhì)體系的穩(wěn)定性。研究顯示，孵化早期蛋清內(nèi)LMW蛋白質(zhì)組成是高度動(dòng)態(tài)變化的。孵化早期(0～5d)蛋清

5、內(nèi)共出現(xiàn)114個(gè)LMW蛋白質(zhì)信號(hào)峰，荷質(zhì)比分布范圍為1035.88～7112.91m/z，不同孵化階段蛋清內(nèi)LMW蛋白質(zhì)組成差異很大。其中，共有28、26、35、35、20、17種LMW蛋白質(zhì)分別出現(xiàn)在孵化0d、1d、2d、3d、4d、5d蛋清內(nèi)。研究證實(shí)，孵化早期蛋清內(nèi)部分大分子蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生降解。
　　 孵化早期濃蛋清的液化、粘度的下降可能與蛋清內(nèi)部蛋白質(zhì)分子間的相互作用或蛋白質(zhì)的降解有關(guān)。比較研究孵化早期濃稀蛋清抗菌特性發(fā)現(xiàn)

6、：孵化早期濃蛋清與稀蛋清pH、溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白含量無(wú)明顯差異。濃稀蛋清轉(zhuǎn)鐵活性、溶壁活性、抗菌活性的變化趨勢(shì)一致。孵化早期蛋清的液化可能減弱其物理防御作用，甚至導(dǎo)致蛋清抗菌蛋白質(zhì)溶菌酶的降解或影響蛋清內(nèi)部蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系，然而孵化過(guò)程中形成的堿性pH環(huán)境及逐漸增強(qiáng)的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白活性可能彌補(bǔ)這種減弱作用。
　　 采用cFDA和PI染料對(duì)孵化蛋清作用后的腸炎沙門(mén)氏菌進(jìn)行熒光染色，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果表明，在蛋清的

7、環(huán)境應(yīng)激之下，腸炎沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出三種生存狀態(tài)：活菌、死菌、膜受損狀態(tài)。采用流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)不同群體特征的菌群進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，不同孵化階段蛋清抑制腸炎沙門(mén)氏菌的作用效力存在較大差異。蛋清抑制腸炎沙門(mén)氏菌的主要作用機(jī)制可能是破壞細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)，這種作用在孵化溫度條件下得到增強(qiáng)；孵化過(guò)程中形成的堿性pH環(huán)境能夠促進(jìn)蛋清破壞細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)的作用效力。
　　 通過(guò)SEM技術(shù)觀察孵化蛋清作用后腸炎沙門(mén)氏菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌細(xì)胞表面表觀結(jié)構(gòu)

8、發(fā)生變化。采用細(xì)胞活性熒光探針(SYTO9/PI)對(duì)孵化蛋清處理后的腸炎沙門(mén)氏菌菌群進(jìn)行熒光染色后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)孵化蛋清處理后的細(xì)菌群體呈現(xiàn)紅、綠兩種熒光，進(jìn)一步證明孵化蛋清能夠?qū)δc炎沙門(mén)氏菌膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷，使其在蛋清內(nèi)呈現(xiàn)不同的活性狀態(tài)。研究采用流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)經(jīng)蛋清處理后呈現(xiàn)不同活性狀態(tài)的細(xì)菌群體進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，與新鮮雞蛋蛋清相比，孵化1d、2d、3d雞蛋清對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌膜結(jié)構(gòu)的破壞作用能力均有所增強(qiáng)。其中，孵化2d蛋清作用效力最

9、強(qiáng)。孵化早期蛋清還能夠抑制腸炎沙門(mén)氏菌hilA基因的表達(dá)，減弱其黏附及入侵Caco-2細(xì)胞活性。
　　 采用細(xì)菌活性熒光探針(SYTO9/PI)標(biāo)記技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)，體外模擬研究了蛋清抗菌因子卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶在孵化早期過(guò)程中的協(xié)同抗菌作用效果。研究發(fā)現(xiàn)，在體外條件下，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠破壞腸炎沙門(mén)氏菌的膜結(jié)構(gòu)；溶菌酶抑制腸炎沙門(mén)氏菌的作用能力相對(duì)較弱。當(dāng)環(huán)境pH增加時(shí)，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶抗腸炎沙門(mén)氏菌的作用活性均增強(qiáng)。卵轉(zhuǎn)鐵