對蝦抗病微生物的篩選及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、益生菌是公認(rèn)的安全有效的對蝦免疫增強(qiáng)物質(zhì),同時(shí)也是控制對蝦病害的主要策略之一,目前欠缺的是對新型高效的功能性菌株的篩選和應(yīng)用研究。本研究是以分離自健康對蝦消化道和養(yǎng)殖環(huán)境的幾株優(yōu)勢菌為研究對象,在考察它們抗WSSV感染效果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析了堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌PC024和溶藻膠弧菌LV463添加到對蝦飼料中,對養(yǎng)殖對蝦免疫酶活性、免疫相關(guān)分子表達(dá)水平以及對WSSV在對蝦體內(nèi)的增殖速率的影響。本研究取得了堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌活菌與溶藻弧菌活菌配合使用

2、可顯著提高凡納濱對蝦抗WSSV感染的能力;抗病菌株通過提高對蝦免疫水平和抗病基因表達(dá)來減緩病毒在對蝦體內(nèi)的增殖,從而發(fā)揮抗病毒保護(hù)作用等重要結(jié)果。本研究篩選的菌株可望以飼料添加劑的方式應(yīng)用于對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn),成為對蝦白斑病生態(tài)防治的有效途徑之一。主要研究內(nèi)容和結(jié)果分以下幾方面:
　　1、海水細(xì)菌主要鑒定方法的應(yīng)用與比較。為了尋求快速準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌的方法,本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用16S Rrna基因序列分析法、細(xì)菌脂肪酸氣相色譜法、ATB微生物鑒

3、定系統(tǒng)、Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)4種方法對分離自健康對蝦腸道和養(yǎng)殖海水的。T6株海水細(xì)菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示:16S rRNA序列分析和細(xì)菌脂肪酸氣相色譜法比ATB法和Biolog法鑒定步驟簡單,且鑒定成本低;16S rRNA序列分析和ATB法鑒定到種的準(zhǔn)確率遠(yuǎn)高于Biolog法和細(xì)菌脂肪酸氣相色譜法。在具體的實(shí)踐中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和設(shè)備條件選擇合適的細(xì)菌鑒定方法,也可以將不同的方法結(jié)合起來得到更加準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。
　　2、一株

4、海水芽孢桿菌的鑒定與生物學(xué)特性分析。從健康中國對蝦養(yǎng)殖海水中分離純化一株優(yōu)勢菌,編號為PC024,形態(tài)學(xué)觀察和革蘭氏染色說明該菌株為革蘭氏陽性菌,2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)24h的菌落呈圓形、中間略微凸起,直徑約為2mm,細(xì)胞呈桿狀,端生芽孢,周生鞭毛。經(jīng)Biolog碳源利用反應(yīng)、脂肪酸氣相色譜分析得出該菌株與堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的生理生化特性最相近;16SrRNA序列測定表明與芽孢桿菌屬中幾株菌的同源性均達(dá)到100％以上,在分子進(jìn)化樹中該菌株與堅(jiān)強(qiáng)

5、芽孢桿菌(Bacillus firmus)的進(jìn)化地位最接近。綜合16S rRNA基因序列分析、ATB微生物自動鑒定系統(tǒng)、BIOLOG微生物自動鑒定系統(tǒng)和細(xì)菌脂肪酸氣相色譜四種方法的鑒定結(jié)果,將該菌株鑒定為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌。
　　3、4株共生菌單一或復(fù)合菌株對凡納濱對蝦抗WSSV感染力的影響。將堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌PC024,蠟樣芽孢桿菌PC465,溶藻弧菌LV463和PC773活菌/滅活菌單一或組合后分別包裹于飼料中應(yīng)用到凡納濱對蝦(Lito

6、penaeus vannamei)的養(yǎng)殖,投喂20 d后,用WSSV進(jìn)行肌肉注射攻毒,感染14 d后統(tǒng)計(jì)每個實(shí)驗(yàn)組的累積死亡率。從感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出:堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌/溶藻弧菌復(fù)合組(B/V組)的累積死亡率顯著低于其他各實(shí)驗(yàn)組和對照組(P<0.05)。飼喂含有堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、兩株溶藻弧菌的飼料均可顯著提高凡納濱對蝦抗WSSV感染的能力,且堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌與溶藻弧菌配合使用的效果最佳。
　　4、飼料中添加益生菌對凡納濱對蝦免疫相關(guān)

7、酶活性的影響。以兩種實(shí)驗(yàn)飼料(芽孢桿菌單一菌組、芽孢桿菌/滅活溶藻弧菌組)和基礎(chǔ)飼料,對凡納濱對蝦進(jìn)行了為期35 d的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。養(yǎng)殖期間每5 d取樣,分析益生菌對對蝦血清和肝胰腺主要免疫酶活性的影響。結(jié)果顯示:免疫期間和感染W(wǎng)SSV期間各實(shí)驗(yàn)組對蝦血清和肝胰腺的酸性磷酸酶活性(ACP)、總超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(L,ZM)、過氧化氫酶(POD)、酚氧化酶(PO)等相關(guān)免疫酶活性和蛋白含量較對照組顯著增加(P<0.05)。結(jié)果提

8、示:益生菌的補(bǔ)充可增強(qiáng)對蝦免疫功能,從而提高對蝦抗WSSV感染的能力。
　　5、飼料中添加益生菌對凡納濱對蝦血淋巴免疫相關(guān)分子表達(dá)水平的影響。飼料的制備與對蝦的養(yǎng)殖同第3章,養(yǎng)殖期間每5d取樣,分析益生菌對對蝦血淋巴酚氧化酶原(proPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)、熱休克蛋白70(HSP70)、脂多糖-β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBP)、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)和β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(βGB

9、P)七種免疫相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)量的影響。Real-time PCR的結(jié)果顯示:免疫期間各基因總體上均顯著高于對照組(P<0.05);病毒感染期間7種基因均呈先上調(diào)達(dá)到最大值后在下降的趨勢。結(jié)果提示:益生菌的補(bǔ)充可激活對蝦血淋巴免疫相關(guān)分子的表達(dá),從而提高對蝦抗WSSV感染的能力。
　　6、飼料中添加益生菌對凡納濱對蝦類淋巴免疫相關(guān)分子表達(dá)水平的影響。飼料的制備與對蝦的養(yǎng)殖同第3章,分析芽孢桿菌/溶藻弧菌組免疫期間和攻毒感染后

10、類淋巴中溶菌酶、酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、熱休克蛋白70、脂多糖-β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子和β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白七種免疫相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)量變化。Real-time PCR結(jié)果顯示免疫期間該組對蝦類淋巴中七種基因的相對表達(dá)量均顯著高于對照組(P<0.05);感染期間,除HSP70和STAT基因相對表達(dá)量在整個感染階段變化不明顯外,其他5種基因均呈先上調(diào)達(dá)到最大值又下降趨勢。結(jié)果提示:益生菌的補(bǔ)充可

11、激活對蝦類淋巴免疫相關(guān)分子的表達(dá),從而提高對蝦抗WSSV感染的能力。
　　7、飼料中添加益生菌對凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV后病毒增殖速率的影響。飼料的制備與對蝦的養(yǎng)殖同第3章,利用絕對定量PCR技術(shù)檢測各實(shí)驗(yàn)組和對照組攻毒后不同時(shí)間對蝦肌肉和鰓組織中WSSV病毒拷貝數(shù)。結(jié)果表明,飼料中添加益生菌的各個實(shí)驗(yàn)組的WSSV病毒拷貝數(shù),在各個取樣時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對照組(P<0.05)。結(jié)果提示:益生菌的補(bǔ)充可降低對蝦感染W(wǎng)SSV后病毒在對蝦體