棕點(diǎn)湍蛙抗微生物短肽的合成及其抗菌作用研究.pdf

1、棕點(diǎn)湍蛙抗微生物短肽是2006年河北師范大學(xué)劉敬澤教授從我國(guó)西南地區(qū)特產(chǎn)棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌液中分離提取的一類(lèi)生物活性短肽,已經(jīng)獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利保護(hù)。為了克服分離提取生物活性短肽高成本的限制,探討化學(xué)合成抗菌肽與天然活性產(chǎn)物的一致性,本文采用Fmoc固相法合成了2種棕點(diǎn)湍蛙抗微生物短肽,并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行了初步分析。
　　 目的：探討棕點(diǎn)湍蛙抗微生物短肽的合成方法,對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定和抗菌效果評(píng)價(jià)。
　　 方法：

2、　　 1、棕點(diǎn)湍蛙抗微生物短肽的理化性質(zhì)分析
　　 1.1短肽1
　　 單鏈多肽,分子量1706.96道爾頓,等電點(diǎn)位8.75。
　　 多肽全序列為:苯丙氨酸—亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸-絲氨酸-脯氨酸-色氨酸-賴(lài)氨酸—谷氨酸-蘇氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸。
　　 或表示為:Phe—Leu-Pro-Pro-Ser-Pro-Trp—Lys—Glu-Thr-Phe-Arg-Thr-Thr。簡(jiǎn)寫(xiě)為:F

3、LPPSPWKGTFRTT。
　　 1.2短肽2
　　 單鏈多肽,分子量133.5.7道爾頓,等電點(diǎn)8.75。
　　 多肽全序列為:亮氨酸-亮氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-纈氨酸-甘氨酸-賴(lài)氨酸-亮氨酸-亮氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-亮氨酸-酰胺化。
　　 或表示為:Leu—Leu—Pro—Ile-Val-Gly-Lys-Leu—Leu—Ser-Gly—Leu—Leu—NH2。簡(jiǎn)寫(xiě)為:LLPIVGKLLSGL

4、L-NH2
　　 2、合成和純化方法設(shè)計(jì)
　　 采用Fmoc固相法,以Wang樹(shù)脂為載體,從C端向N端依次進(jìn)行保護(hù)氨基酸的縮合反應(yīng),經(jīng)肽樹(shù)脂裂解,RP-HPLC方法純化合成產(chǎn)物。
　　 3、合成條件的優(yōu)化
　　 3.1高效合成方法的選擇
　　 分別采用手工合成和CS136XT型自動(dòng)多肽合成儀方法,比較合成產(chǎn)物的產(chǎn)量和純度,結(jié)合不同方法的合成規(guī)模、所需時(shí)間、原料利用、合成成本,優(yōu)選高效合成方法。

5、r>　　 3.2 Wang樹(shù)脂的溶脹時(shí)間的選擇
　　 比較5—35min時(shí)65％DCM／DMF對(duì)Wang樹(shù)脂的溶脹情況,以及不同溶脹時(shí)間樹(shù)脂的Fmoc-Thr(oBt-)-OH偶聯(lián)效率,優(yōu)選Wang樹(shù)脂的活化時(shí)間。
　　 3.3氨基酸樹(shù)脂封閉的檢測(cè)
　　 比較未乙酰化和乙?；蟮陌被針?shù)脂生成多肽的純度,證明氨基酸樹(shù)脂封閉對(duì)取得高純度合成產(chǎn)物的必要性。
　　 3.4縮合劑的選擇
　　 分別采用縮

6、合劑HBTU和DCC合成短肽,比較不同縮合劑方法合成產(chǎn)物的氨基酸連接率、產(chǎn)量和純度。
　　 3.5縮合反應(yīng)時(shí)間的選擇
　　 在加入氨基酸后0.5h到3h,Kziser法檢測(cè),優(yōu)選氨基酸縮合反應(yīng)的最佳時(shí)間。
　　 3.6縮合劑配比的選擇
　　 分別采用氨基酸:HBTU:DIEA=1:0.9:2和氨基酸:HBTU:DIEA=1:1:l的配比,比較氨基酸的連接率和多肽產(chǎn)量。
　　 3.7反應(yīng)溶劑的選擇<

7、br>　　 分別選用極性溶劑DMF、非極性溶劑DCM和混合溶劑65％DCM／DMF(v／v)為反應(yīng)溶劑,比較氨基酸的連接率和產(chǎn)量。
　　 3.8氨基酸脫Fmoc保護(hù)試劑濃度和時(shí)間的選擇
　　 采用不同濃度DMF／哌啶混合溶液,比較不同濃度和時(shí)間下的的哌啶溶液氨基酸脫保護(hù)的情況。
　　 3.9肽樹(shù)脂裂解試劑的選擇
　　 采用以下4種不同的裂解劑,優(yōu)選合成短肽和樹(shù)脂的裂解方式。
　　 A:TFA／p

8、henol(v／v=95／5)；
　　 B:TFA／H2O(v／v=95／5)；
　　 C:TFA／H2O／EDT(v／v／v=95／2.5／2.5)；
　　 D:TFA／phenol／H2O／thioanisole／EDT(v／v／v／v=82.5／5／5／2.5)。
　　 4、短肽的批量合成
　　 通過(guò)合成工藝條件的優(yōu)化,確定采用混合溶劑65％DCM／DMF(v／v)為氨基酸活化酯與樹(shù)脂連接的

9、介質(zhì),HBTL,為縮合劑,縮合配比為:氨基酸:HBTU:DIEA=1:0.9:2,反應(yīng)時(shí)間為2h,CS136XT型自動(dòng)多肽合成儀Fmoc固相合成棕點(diǎn)湍蛙抗微生物短肽。
　　 5、合成產(chǎn)物的純化條件優(yōu)化
　　 5.1有機(jī)相的選擇
　　 RP-HPLC方法比較甲醇和乙腈兩種不同有機(jī)相體系分離純化多肽的分離度,綜合成本、毒性等因素選擇有機(jī)相。HPLC圖譜求出峰時(shí)間,計(jì)算不同產(chǎn)物純化的最佳出峰梯度(有機(jī)相最佳梯度)和線性

10、梯度。
　　 5.2色譜柱的選擇
　　 分別用C8和C18對(duì)多肽進(jìn)行分離純化,分析譜圖的分離效果,選擇最佳的色譜柱進(jìn)行分離提純。
　　 6、批量合成產(chǎn)物的純化
　　 RP-HPLC方法,C18半制備柱型色譜柱,流動(dòng)相水相為:水+0.1％TFA,有機(jī)相為:乙腈+0.1％TFA,線性洗脫,流動(dòng)相流速為3ml／min,檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。
　　 7、合成產(chǎn)物的分析和鑒定
　　 Kr00-5 C1

11、8分析型色譜柱,面積歸一法計(jì)算合成產(chǎn)物的含量,對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行分析和鑒定。
　　 利用基質(zhì)輔助激光吸收離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行分子量的確定,確定結(jié)構(gòu)。
　　 8、合成產(chǎn)物的抗菌作用分析
　　 采用大腸埃希菌和會(huì)色葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)菌種,分別測(cè)定合成抗菌肽,硫酸慶大霉素、青霉素、鏈霉素以及抗菌肽與三者分別聯(lián)合使用的抑菌效果。
　　 結(jié)果：
　　 1、短肽合成條件的優(yōu)化<

12、br>　　 1.1高效合成方法的選擇
　　 在投料為1gWang樹(shù)脂(Sub=1.1mmol／g),氨基酸、縮合劑投料相同,反應(yīng)介質(zhì)相同的條件下,手工和CS136XT型自動(dòng)多肽合成儀2種方法同時(shí)合成棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽。粗肽產(chǎn)量分別為0.14g、0.26g；純度分別為:57.39％、67.94％。
　　 1.2 Wang樹(shù)脂的活化
　　 Wang樹(shù)脂在混合溶劑65％DCM／DMF(v／v)中30min以上溶脹完全,

13、與Fmoc-Thr(oBt)-OH偶聯(lián)效率較高。
　　 1.3不同縮合劑對(duì)氨基酸連接率的影響
　　 采用HBTU為縮合劑合成抗菌肽,氨基酸的連接率和未經(jīng)純化初步產(chǎn)物的純度明顯高于以DCC為縮合劑。
　　 1.4不同反應(yīng)介質(zhì)對(duì)氨基酸連接率的影響
　　 Fmoc固相法合成抗菌肽,混合溶劑65％DCM／DMF(v／v)為介質(zhì)的氨基酸縮合反應(yīng),氨基酸的連接率明顯高于單一的以極性溶劑DMF和非極性溶劑DCM為介質(zhì)的

14、反應(yīng)。
　　 1.5時(shí)間因素對(duì)氨基酸縮合程度的影響
　　 Kziser法檢測(cè)氨基酸與樹(shù)脂的連接程度,不同氨基酸在抗菌肽的合成中時(shí)間達(dá)到2h均已充分反應(yīng)。
　　 1.6縮合劑投料比對(duì)縮合反應(yīng)的影響
　　 縮合劑采用HBTU,投料比為:氨基酸:HBTU:DIEA=1:0.9:2時(shí),氨基酸縮合反應(yīng)時(shí)間短、連接率高。
　　 1.7對(duì)未反應(yīng)氨基的乙酰化
　　 每次在氨基酸縮合反應(yīng)完全后,對(duì)未反應(yīng)的氨

15、基進(jìn)行乙酰化,與未封閉系統(tǒng)比較,可明顯提高合成粗肽的純度。
　　 1.8脫保護(hù)試劑的濃度和時(shí)間
　　 脫保護(hù)試劑為20％哌啶／DMF混合溶液,脫保護(hù)時(shí)間為20分鐘／每次,脫保護(hù)效率可達(dá)到99％。
　　 1.9切割試劑的效果
　　 本實(shí)驗(yàn)采用的切割試劑TFA／phenol／H2O／thioanisole／EDT(v／v／v／v=82.5／5／5／2.5)切割后的樹(shù)脂是原來(lái)的20％,用乙醚處理濾液無(wú)白色物質(zhì)生

16、成,說(shuō)明切割相對(duì)徹底。
　　 2、抗微生物短肽純化的優(yōu)化
　　 2.1不同有機(jī)體系對(duì)純化效果的影響
　　 采用C18分析型色譜柱分離純化抗菌肽,經(jīng)RP-HPLC圖譜分析,有機(jī)相為甲醇時(shí),抗菌肽保留時(shí)間短,與雜峰接近,不便于提純；而有機(jī)相為乙腈時(shí),抗菌肽保留時(shí)間在13min到19min之間,距離雜峰較遠(yuǎn),便于提純。
　　 2.2不同色譜柱對(duì)純化效果的影響
　　 采用乙腈為有機(jī)相,經(jīng)RP-HPLC圖譜

17、分析,用C8分析型色譜柱,未經(jīng)純化的抗菌肽的主峰和雜峰不易分開(kāi),且有較大的拖尾峰；用C18分析型色譜柱,未經(jīng)純化的抗菌肽的主峰和雜峰能很好的分離,且沒(méi)有拖尾峰。
　　 3、人工合成抗微生物短肽的抗菌活性分析
　　 合成抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性的大腸埃希氏菌均有一定的殺菌作用,MBC值分別為200μg／ml和100μg／m。合成抗菌肽與青霉素、鏈霉素聯(lián)合使用后抗菌作用增強(qiáng),其中與青霉素聯(lián)合使用的效果明

18、顯,對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC值達(dá)到青霉素／合成肽0.625／251μg／ml。合成肽顯著提高了經(jīng)典抗生素的殺菌作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.經(jīng)工藝優(yōu)化,棕點(diǎn)湍蛙抗微生物短肽最佳的合成工藝為:Fmoc固相合成,利用CS136XT型多肽合成儀,Wang樹(shù)脂為固相載體,65％DCM／DMF(v／v)為反應(yīng)溶劑,HBTU為縮合劑,單個(gè)氨基酸反應(yīng)時(shí)間為2h。確定基本純化條件為:采用C18型色譜柱,流動(dòng)相A:水+0.1％TFA,流

19、動(dòng)相B:純乙腈+0.1％TFA,線性梯度洗脫,流動(dòng)相流速為1ml／min,檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。本課題采用的Fmoc固相合成棕點(diǎn)湍蛙抗微生物短肽反應(yīng)條件溫和,重復(fù)性好,產(chǎn)物純度高,MS檢測(cè)分子量與預(yù)期相符。
　　 2.人工合成棕點(diǎn)湍蛙抗微生物短肽對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用弱于生物化學(xué)方法提取的天然棕點(diǎn)湍蛙抗微生物短肽,提示人工合成抗菌肽與天然產(chǎn)物之間空間結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了改變,人工合成的棕點(diǎn)湍蛙抗菌肽尚需在構(gòu)效關(guān)系分析基礎(chǔ)上