生菜維生素E生物合成途徑基因LsHPPD和LsHPT的克隆及轉化研究.pdf

1、維生素E是一類脂溶性抗氧化劑的統(tǒng)稱，可分為生育酚和生育三烯酚兩大類，它們對于人體的營養(yǎng)健康具有重要意義。維生素E只能在光合自養(yǎng)生物（如高等植物和藍藻）中合成。人體日常所需的維生素E主要是通過植物類食物和藥物來補充。生菜是一種被廣泛食用的蔬菜，利用遺傳工程的方法改良生菜維生素E的合成途徑，并提高維生素E的含量，對于提高其營養(yǎng)價值具有重要的現(xiàn)實意義。本文選擇常見生菜品系Lactuca sativaL. var. longifolia（rom

2、aine lettuce，羅蔓生菜）作為研究對象，探索維生素E生物合成途徑上的三個關鍵酶：4-羥苯丙酮酸二加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）、尿黑酸植基轉移酶（homogentisate phytyltransferase, HPT）和γ-生育酚甲基轉移酶（γ-tocopherol methyltransferase，γ-TMT）對生菜維生素E合成途徑的影響。具體工作包括以下四個方

3、面：
　　1.生菜LsHPPD和LsHPT基因的克隆及分析。從生菜中克隆了編碼4-羥苯丙酮酸二加氧酶和尿黑酸植基轉移酶的基因, LsHPPD和LsHPT（GenBank登錄號分別為FJ194493和FJ194492）。LsHPPD基因的cDNA序列全長1,743 bp，編碼一個含446個氨基酸的蛋白質。通過蛋白質氨基酸序列多重比對發(fā)現(xiàn)，LsHPPD與蒺藜苜蓿HPPD序列具有77％的同源性。已知HPPD需要與Fe2+相互作用才能具備

4、正常的催化活性，根據(jù)蛋白質序列分析以及三維結構預測的結果，推測出LsHPPD的His-222、His-304和Glu-390是其與Fe2+相互作用的氨基酸殘基。LsHPT基因的cDNA序列全長1,670 bp，編碼一個含395個氨基酸的蛋白質。LsHPT與擬南芥HPT具有68%的同源性。據(jù)報道擬南芥和菠菜的HPT蛋白質都定位于葉綠體膜表達。在對LsHPT的氨基酸序列進行分析時發(fā)現(xiàn)：LsHPT是一種具有高度疏水性的蛋白質，在其N端有一段7

5、5個氨基酸的葉綠體定位信號序列，推測LsHPT蛋白可能也定位于葉綠體膜表達。Southern blot分析表明這兩個基因在生菜基因組中都是以低拷貝形式存在的。組織表達分析結果表明，LsHPPD和LsHPT基因在種子中的表達量最高，在第5-10片葉片中次之，在第1-2片葉片、根、子葉和莖中表達量較低。在LsHPPD和LsHPT基因表達水平較高的組織中生育酚總量一般也相對較高。對生菜分別進行強光、干旱及低溫等脅迫處理以及茉莉酸甲酯、脫落酸等

6、激素誘導后發(fā)現(xiàn)，LsHPPD和LsHPT基因的表達量和生育酚含量均顯著提高。上述結果表明，LsHPPD和LsHPT基因對于不同組織中以及不同脅迫誘導條件下生菜維生素E的合成具有關鍵作用。
　　2.LsHPPD和LsHPT基因在生菜中的瞬時表達分析。為了進一步研究LsHPPD和LsHPT基因對生菜維生素 E合成的影響，采用農(nóng)桿菌滲入法（Agroinfiltration）對生菜進行瞬時轉化，使生菜中LsHPPD和LsHPT基因的表達量

7、在短時間內迅速提高。實時熒光定量RT-PCR的結果表明，LsHPPD和LsHPT基因表達量（用2-ΔΔCt值表示）分別達到對照的13.18倍和12.47倍。HPLC檢測結果表明LsHPPD基因的瞬時表達可使α-生育酚的含量提高到25.57±1.37μg/g FW，為對照的5.37倍；LsHPT基因的瞬時表達可使α-生育酚的含量提高到88.44±3.15μg/g FW，為對照的18.58倍。瞬時表達的結果表明，提高LsHPPD和LsHPT

8、基因的表達水平可以促進生育酚的合成，其中LsHPT基因在提高生育酚含量方面的作用效果又要優(yōu)于LsHPPD基因。
　　3.LsHPPD和LsHPT基因在擬南芥和生菜中的穩(wěn)定表達分析。在瞬時表達的基礎上，為了研究LsHPPD和LsHPT基因的穩(wěn)定轉化對于維生素E合成途徑的影響是否與之相似，采用LsHPPD和LsHPT基因對擬南芥進行遺傳轉化。在獲得的表達 LsHPPD和LsHPT基因的轉基因擬南芥植株中，α-生育酚和γ-生育酚的總量可

9、分別提高到野生型植株的1.51倍和2.09倍，說明LsHPPD和LsHPT基因的穩(wěn)定轉化可以促進植株中維生素E的合成。繼而將 LsHPPD和LsHPT基因用于生菜的遺傳轉化，以期提高其中生育酚的含量，從而改善生菜的營養(yǎng)品質。結果表明：在過量表達LsHPPD基因的生菜中，α-生育酚和γ-生育酚的總量提高至11.57±0.39μg/g FW，是野生型植株的1.70倍；在過量表達LsHPT基因的生菜中，其總量可提高至17.77±0.41μg/

10、g FW，是野生型植株的2.61倍。在T1代轉基因植株中，目的基因的表達量和生育酚含量仍保持較高的水平，表明其具有遺傳穩(wěn)定性。
　　4.擬南芥AtHPT和AtTMT雙基因共轉化生菜的研究。過量表達LsHPPD和LsHPT基因，尤其是其中的LsHPT基因，可以提高生菜中α-生育酚和γ-生育酚的總量。然而這兩個基因的過量表達卻無法改變生菜中生育酚的組成。將AtHPT和AtTMT基因構建雙基因共轉化載體，對生菜進行遺傳轉化。結果表明在轉

11、基因生菜中，生育酚總量可提高至13.62±0.26μg/g FW，α-生育酚:γ-生育酚的比值提高至4.24，最終可使維生素E活性提高到對照的3.51倍。因而通過同時過量表達AtHPT和AtTMT基因可以使生育酚總量和其中α-生育酚所占的比例都有所提高，從而提高生菜中總維生素E的活性。
　　本文成功克隆了生菜 LsHPPD和LsHPT基因，并通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化分別獲得生菜及擬南芥的轉基因植株，使其中維生素E的含量和活性都顯著