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文檔簡介
1、花生(Arachis hyogaea L.)是世界上四大油料作物之一,在世界范圍內的熱帶和亞熱帶地區(qū)都有種植。中國是世界上最大的花生生產國和消費國。維生素E是一種脂溶性的抗氧化劑,在人體、動物以及植物體內都有重要的生理作用。植物油是人類攝取維生素E的主要途徑。植物包括花生在內具有高活性α-維生素E的含量非常低,為了提高花生中維生素E的含量,本研究試圖通過基因工程的辦法改良現有的花生品種。本文報道維生素合成途徑中的重要基因尿黑酸合成酶(V
2、E2)基因、2-甲基-6-植基-苯醌甲基轉移酶(VE3)基因和γ-生育酚甲基轉移酶(VE4)基因的克隆,種子特異表達啟動子引導的植物表達載體構建,以及這些載體對花生進行遺傳轉化的研究結果。 1、為了使維生素E相關的基因在花生胚中特異表達,通過PCR的方法在同源性分別為99.8%和100%的T載體中分離得到兩個種子特異表達啟動子。它們分別是大豆種子儲藏蛋白啟動子(7S)和油菜種子儲藏蛋白啟動子(2S)。這兩個啟動子的長度分別為79
3、5bp和1058bp。 2、提取擬南芥(Arabidopsis thaliana)葉子的總RNA,并根據GenBank所發(fā)表的VE2、VE3和VE4序列設計引物,通過RT-PCR的方法分離得到這3個基因,它們和Genank上所發(fā)表的序列同源性分別為98%、100%和100%。把這三個基因分別構建到中間表達載體pSPROK中,并且在VE2基因的上游插入7S,在VE3和VE4基因上游分別插入N2S,來調控這3個基因在種仁特異表達。然
4、后從這3個載體中酶切出分別帶有啟動子、基因和終止子的完整表達單元,構建到植物表達載體pCAMBIA1300中,所構建成的植物表達載體分別命名為pCAMBIA1300VE2·7S、pCAMBIA1300VE3·2S和pCAMBIA1300VE4·2S。測序分析顯示3個基因的完整表達單元成功構建在植物表達載體pCAMBIA1300中。 3、為了更高效地改良花生中維生素E的合成效率,在單價載體的基礎上構建了一個雙價植物表達載體pCAM
5、BIA1300 VE2·VE3,它含有VE2和VE3各自的啟動子和終止子表達單元。為了同時改良花生中維生素E含量和油酸含量,亦構建得到雙價植物表達載體pCAMBIA1300AT,它含有VE4的完整表達單元和FAD2的反義RNA表達單元。 4、將pCAMBIA1300VE4-2S、pCCAMBIA1300AT、pCAMBIA13002a等3個植物表達載體通過根癌農桿菌介導對花生進行遺傳轉化,提取抗性苗DNA進行PCR反應顯示,他們
6、的表達單元都已經插入到花生基因組中,各得到轉基因苗3株、3株和6株,轉化率分別為:2.00%、2.00%和3.85%。由于這些基因都是由種子特異表達啟動子所引導,應待轉基因苗種子收獲后再作進一步檢測。 綜上所述,本研究構建了5個植物種子特異表達載體用來提高花生得維生素E含量,并將pCAMBIA1300VE4-2S、pCAMBIA1300AT、pCAMBIA13002a等3個載體對花生進行了轉化,得到了轉基因植株,為改良花生維生素
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