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文檔簡介
1、目的:鈣離子通道是一組跨越細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)大分子,它嚴(yán)格控制著鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的過程,產(chǎn)生維持細(xì)胞生理必需的電化學(xué)信號,在細(xì)胞病生理學(xué)方面有很重要的作用。
鈣離子通道阻滯藥(Calcium Channel Blocker,CCB)可以選擇性地抑制Ca2+經(jīng)細(xì)胞膜上的鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),具有松弛血管平滑肌,減少末梢血管阻力,從而降低血壓的作用,但腦、冠狀動脈和腎血流量不減少。同時,此類藥物也存在負(fù)性肌力作用,可抑制心肌的收縮力及傳
2、導(dǎo)。
CCB種類很多,主要選擇性地作用于L-型鈣離子通道(L-type calciumchannels,LTCC),結(jié)合部位在αlc亞單位,并根據(jù)其具體結(jié)合點(diǎn),又分為三個亞類:二氫吡啶類、地爾硫卓類和苯烷胺類。
二氫吡啶類藥物(Dihydropyridines,DHPs)具有廣泛的應(yīng)用范圍,例如在血管舒張、支氣管擴(kuò)張、抗動脈硬化、抗糖尿病、抗基因誘變以及抗驚厥等方面均有明顯的藥理學(xué)作用。最初DHPs是作為心血
3、管疾病的治療藥物而被廣泛應(yīng)用,目前已逐漸在其他方面發(fā)揮其藥理作用。比如,尼莫地平作為抗局部缺血的藥物應(yīng)用于阿茲海默病的治療中,除此之外在治療癡呆、偏頭痛及腦出血后的血管痙攣等方面也均有作用。硝苯地平也可用于治療偏頭痛、肥厚性心肌病以及雷諾現(xiàn)象等。同時硝苯地平還可應(yīng)用于糖尿病性神經(jīng)病變的治療。
如何在利用此類藥物最大功效的同時盡可能降低其副作用,對于臨床治療有著極其重要的意義。因此,鈣離子通道的內(nèi)部轉(zhuǎn)化機(jī)制以及鈣離子通道阻滯
4、劑的作用機(jī)制成為本課題的研究重點(diǎn)。
一般LTCC包括三種狀態(tài),即開放狀態(tài)(open state,O),失活狀態(tài)(inactivation state,I)以及關(guān)閉狀態(tài)(close state,C)。其中失活過程又包括電壓依存性失活(voltage dependent inactivation,VDI)及鈣離子依存性失活(calcium depe:ndent inactivation,CDI)兩種。通道動力學(xué)研究顯示DHPs
5、類藥物主要通過穩(wěn)定通道的失活狀態(tài)從而對通道發(fā)揮抑制作用,但其具體的機(jī)制尚不清楚。
Timothy綜合征(Timothy Syndrome,TS)是一類由鈣離子通道損害導(dǎo)致的先天性疾病,有研究表明其LTCC的Ⅰ-Ⅱ linker部位的氨基端即(αlc亞單位的第436位氨基酸一甘氨酸突變成了精氨酸(G436R)。這一突變型與野生型LTCC比較,主要差別在于VDI的速率顯著減低。本課題主要以研究L-型鈣離子通道失活狀態(tài)的詳細(xì)機(jī)制
6、為突破口,通過使用基因突變型(Timothy Syndrome L-type calcium channel,TS—LTCC)通道與野生型(wild type L-type calcium channel,WT-LTCC)通道進(jìn)行對比,對通道的失活過程進(jìn)行定性分析,并探討二氫吡啶類藥物對通道失活的具體作用機(jī)制。
方法:
1通道蛋白的制備
1.1 LTCC的α2δ及β2亞單位的制備
7、1.2 LTCC的αlc亞單位的突變型G436R的制備
2細(xì)胞及LTCC蛋白質(zhì)表達(dá)的準(zhǔn)備
2.1 HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)
2.2制備LTCC的α2γ及β2亞單位兩者均穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系
2.3野生型及突變型LTCC的表達(dá)
3應(yīng)用膜片鉗記錄通道的各項(xiàng)數(shù)據(jù)
3.1電極管的拉制
3.2細(xì)胞內(nèi)液及各種細(xì)胞外液配制
3.3實(shí)驗(yàn)程序設(shè)定
8、r> 3.4全細(xì)胞模式下記錄通道的各項(xiàng)數(shù)據(jù)
4膜片鉗獲得數(shù)據(jù)的分析
4.1 VDI的分析
4.2 Recovery的分析
4.3 Nifedipine的dose-response曲線測定
5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
結(jié)果:
建立了同時表達(dá)α2γ及βp2亞單位兩種蛋白質(zhì)的穩(wěn)定細(xì)胞系。很大程度上減小了因多種蛋白質(zhì)同時轉(zhuǎn)染幾率的不同而造成的誤差,使得數(shù)據(jù)
9、的來源更加可靠。通過使用此穩(wěn)定細(xì)胞系,分別瞬時轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)與野生型LTCC或突變型LTCC,從而將LTCC的3個主要亞單位αlc,α2δ及β2同時表達(dá),得到完整的L型鈣離子通道電流。此后,在膜片鉗全細(xì)胞模式記錄試驗(yàn)中得到的電流經(jīng)過細(xì)胞外液改為鈣通道阻斷劑氯化鎘之后完全消失,進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所記錄的電流正是L型鈣離子通道的電流。
所記錄數(shù)據(jù)的分析:所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用IGOR6.0分析軟件進(jìn)行的分析計(jì)算,結(jié)果如下:
10、r> 1失活(inactivation)的相關(guān)分析
1.1 Tau(τ)
時間常數(shù)以τ來表示,代表通道失活的速率,其值越小,速率越快,反之亦然。LTCC有快失活及慢失活兩種過程,兩種通道的τ均根據(jù)雙指數(shù)函數(shù)(biexponenntial function)條件經(jīng)曲線擬合(fit)后得出。其中野生型LTCC的τfast為496.23 ms,突變型LTCC則為1270.51 ms。野生型LTCC的τ_slo
11、w為3016.11 ms,突變型LTCC則為6358.5 ms。
1.2 R1及R20
R1及R20分別代表通道失活開始1 s及20 s后殘余的未失活部分占總體電流量的比例。野生型LTCC的R1及R20分別是0.29和0.004,而突變型LTCC的R1及R20則分別是0.67和0.08。
1.3 Relative Af,As,A0
Relative Af,As及A0分別代表在失活過
12、程中快失活,慢失活以及未失活的部分所占整體的比例。野生型LTCC的Relative Af,As及A0分別為0.71,0.29及0.01。突變型LTCC的Relative Af,As及A0則分別為0.29,0.65及0.05。
2復(fù)活(recovery)的相關(guān)分析
LTCC復(fù)活過程也是由快復(fù)活及慢復(fù)活兩種成分組成:
2.1 Tau(τ)
同上也是指時間常數(shù)。野生型LTCC的τ同上根據(jù)
13、雙指數(shù)函數(shù)條件經(jīng)曲線擬合后得出。其中τ fast為1.60s,τ_slow為13.40s。而突變型LTCC的τ則是根據(jù)單指數(shù)函數(shù)(single exponential function)條件經(jīng)曲線擬合后得出的,僅有τ_slow一項(xiàng),其值為25.90 s。
2.2 Relative Af及As
Relative Af及As代表意義同上。經(jīng)計(jì)算得出,野生型LTCC的RelativeAf及As分別是0.21及0.7
14、4。而突變型LTCC的Relative As值為0.94,Relative Af不存在。
3硝苯地平的劑量反應(yīng)關(guān)系曲線(Dose-Response Curve)
細(xì)胞外液成分加入硝苯地平,濃度分別為0.1 nM,1 nM,10 nM,100nM,1μM以及10μM每毫升。記錄這些條件下LTCC的電流抑制率,最后得出硝苯地平對于野生型及變異型LTCC的濃度反應(yīng)關(guān)系曲線。兩條曲線的半數(shù)抑制濃度(IC50)差別不大
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