鼠尾草酸通過誘導(dǎo)二相酶降低HepG2細(xì)胞氧化損傷的作用與PI3K-Akt-Nrf2轉(zhuǎn)錄途徑之間的關(guān)系.pdf

1、目的:研究鼠尾草酸通過二相酶的誘導(dǎo)對(duì)HepG2細(xì)胞H2O2損傷的保護(hù)作用與PI3K/Akt-Nrf2轉(zhuǎn)錄途徑之間的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.鼠尾草酸對(duì)HepG2細(xì)胞二相酶的誘導(dǎo)作用
　　 HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為四組:對(duì)照組;低、中、高濃度鼠尾草酸組(5μM、10μM、20μM)。藥物與細(xì)胞共同孵育不同時(shí)間后分別測(cè)定以下指標(biāo):采用化學(xué)分光光度法測(cè)定醌氧化還原酶(NQO1)的活性和還原型谷胱甘肽(GSH)的活性

2、;用免疫印跡法(Western blotting)測(cè)定轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、NQO1和血紅素氧合酶-1(HO-1)的蛋白表達(dá)。
　　 2.鼠尾草酸對(duì)HepG2細(xì)胞二相酶誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究
　　 (1)HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為:對(duì)照組;20μM鼠尾草酸組;20μM鼠尾草酸+阻斷劑組(PI3K通路阻斷劑LY294002組、NQO1抑制劑Dicoumarol組、HO-1抑制劑ZNPPIX組)。Western blotting法測(cè)

3、定轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達(dá)。
　　 (2)HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為:對(duì)照組;PI3K阻斷劑組;20μM鼠尾草酸組:20μM鼠尾草酸+PI3K阻斷劑組。Western blotting法測(cè)定Akt和P-Akt的蛋白表達(dá)。
　　 3.鼠尾草酸對(duì)H2O2損傷的HepG2細(xì)胞保護(hù)作用研究
　　 (1)HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為:對(duì)照組;H2O2損傷組(終濃度為2.4mM);低、中、高濃度鼠尾草酸治療組(5

4、μM、10μM、20μM)。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率;采用化學(xué)分光光度法測(cè)定細(xì)胞上清液中LDH活性。
　　 (2)HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為:對(duì)照組;H2O2損傷組;20μM鼠尾草酸治療組;20μM鼠尾草酸+阻斷劑組。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率;采用化學(xué)分光光度法測(cè)定細(xì)胞中LDH活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.鼠尾草酸與HepG2細(xì)胞共同孵育8h后,與對(duì)照組相比,藥物組的細(xì)胞內(nèi)二相酶GSH和NQO1活性均明顯提高(

5、P＜0.01,P＜0.01),在5～20μM呈濃度依賴性。16h時(shí),上述兩種酶的活性均有不同程度的降低,呈一定的時(shí)間相關(guān)性。
　　 2.鼠尾草酸與HepG2細(xì)胞共同孵育8h后,與對(duì)照組相比,中、高濃度藥物組細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達(dá)顯著提高(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01),并呈一定的濃度依賴性。
　　 3.PI3K通路的特異性阻斷劑LY294002可以明顯抑制鼠尾草酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞Nr

6、f2、NQO1和HO-1的蛋白表達(dá)(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01)。鼠尾草酸誘導(dǎo)的NQO1和HO-1的蛋白表達(dá)還可分別被特異的NQO1抑制劑Dicoumarol、HO-1抑制劑ZNPPIX所抑制(P＜0.01,P＜0.01)。
　　 4.與對(duì)照組相比,鼠尾草酸不影響Akt的水平,但可明顯增加P-Akt的蛋白表達(dá)水平。在鼠尾草酸同時(shí)存在或不存在時(shí),PI3K通路的特異性阻斷劑LY294002可明顯減少P-Akt的蛋白表達(dá)

7、。
　　 5.H2O2刺激HepG2細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,損傷組細(xì)胞生存率明顯下降,LDH活性明顯增高(P＜0.01,P＜0.01),而中、高濃度鼠尾草酸處理組細(xì)胞生存率顯著提高,LDH活性顯著下降(P＜0.01,P＜0.01),呈濃度依賴性。而且,特異性P13K通路阻斷劑LY294002、NQO1抑制劑Dieoumarol以及HO-1抑制劑ZNPPIX可以部分取消鼠尾草酸的細(xì)胞保護(hù)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1