咖啡因長期暴露影響甜味偏好及腸道糖吸收的基礎研究.pdf

1、咖啡因具有幾千年的使用歷史,是世界范圍內(nèi)最普遍消費的活性食物成分。關于咖啡因廣泛食用而產(chǎn)生的厭食作用,從而幫助人們維持或降低體重這一觀點一直存在爭議。而且目前對于咖啡因引起的厭食作用研究僅僅是從動物及人類對食物的認知及動機出發(fā),對于其具體的機制尚不清楚。味覺是動物攝食行為的主要調(diào)節(jié)及驅(qū)動因子,咖啡因暴露后引起的厭食作用是否來自于味覺基礎的變化尚未見報道。所以本研究結合近年來味覺感受機制、味覺感受影響因素和味覺可塑性等研究成果,提出了咖啡

2、因長期暴露改變攝食行為以味覺外周感受器味蕾的變化為基礎的假設。以ICR小鼠為動物模型,采用動物行為學、免疫組織化學、Western blot、實時熒光PCR及ELISA等多種方法相結合,探究了咖啡因長期暴露不同年齡段小鼠味覺行為改變與外周感受器即味蕾特征性變化(包括味蕾及味蕾細胞形態(tài)變化、味覺感受相關蛋白表達量變化)之間的相關性;同時延伸了咖啡因長期暴露作用,探討了咖啡因長期暴露對小腸絨毛形態(tài)、甜味感受相關蛋白表達及腸道內(nèi)葡萄糖吸收的影

3、響;并且通過不同咖啡因刺激方式探討了食物口腔感受及食物攝入后作用在味覺感受變化中的貢獻。實驗結果從多角度揭示了外周味覺感受器變化與咖啡因引起厭食作用的相關性,為咖啡因長期作用引起的厭食作用提供了味覺感受基礎方面的理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結果如下:
　　 (1)咖啡因長期暴露改變小鼠味覺偏好
　　 不同年齡段正常組小鼠對咖啡因表現(xiàn)出不同的偏好模式,P24小鼠表現(xiàn)為典型的“冷漠-回避”模式,回避閾值為5.17 mmol/L;

4、而P32及P49小鼠表現(xiàn)為典型的“冷漠-偏好-回避”,偏好閾值分別為0.92mmol/L和0.09 mmol/L,回避閾值分別為5.17 mmol/L和16.28mmol/L。與對照組小鼠性比,咖啡因暴露對不同年齡段小鼠咖啡因味覺偏好模式無影響,但增強各年齡段小鼠耐受性。青春前期及青春期小鼠表現(xiàn)為偏好率的增加,而青春期及成年小鼠還表現(xiàn)為偏好閾值的升高,偏好閾值分別為5.17 mmol/L和0.29 mmol/L。各個年齡段對照組及咖啡因

5、暴露組小鼠具有相同的AK糖偏模式及最佳偏好濃度,表現(xiàn)為典型的“冷漠-偏好-回避”模式。但咖啡因長期暴露改變小鼠AK糖偏好閾值及偏好率,此作用具有刺激起始年齡差異性。與對照組小鼠相比,咖啡因暴露后降低青春前期小鼠AK偏好閾值,分別為1.33 mmol/L和0.42 mmol/L;而青春期及成年期刺激組小鼠表現(xiàn)為偏好閾值升高,均為0.42 mmol/L/1.33 mmol/L,偏好率降低,分別降低約6％和13.83％?？傊鲜鼋Y果表明不同年

6、齡段小鼠咖啡因味覺偏好模式不同,為其他以咖啡因為研究對象的行為學研究提供了實驗依據(jù);其次本研究證明了咖啡因長期暴露后小鼠甜味偏好降低,為以小鼠為模型的咖啡因長期暴露引起可口食物厭膩感作用研究提供了行為學依據(jù)。
　　 (2)咖啡因長期暴露改變小鼠菌狀味蕾解剖形態(tài)特征
　　 咖啡因長期暴露對舌面味蕾總數(shù)的影響無咖啡因暴露劑量差異性,除青春期500 mg/L對照組小鼠外,長期咖啡因暴露不改變小鼠舌面菌狀味蕾總數(shù),單個舌面味蕾數(shù)

7、量基本位于100-110個之間?？Х纫蜷L期暴露后各年齡段小鼠菌狀味蕾最大橫截面積雖無顯著變化,橫截面積基本位于1500-1600μm2之間,但與對照組小鼠相比,青春期及成年咖啡因刺激組小鼠菌狀味蕾最大橫截面呈明顯減少趨勢;同時味蕾縱軸高度也因咖啡因暴露而顯著降低,與對照組小鼠相比,青春前期、青春期及成年激組小鼠味蕾高度分別降低13％/11％、13％/13％、13％/13％(300 mg/L/500 mg/L刺激組);而且咖啡因長期暴露后

8、單個味蕾中細胞總數(shù)也呈減少趨勢,尤其是青春期及成年小鼠味蕾細胞總數(shù)顯著減少,與對照組相比分別減少20％/14％、15％/8％(300mg/L/500 mg/L刺激組),而且具有顯著的咖啡因暴露劑量差異性。綜上所述咖啡因長期暴露通過減少味蕾最大橫截面積、味蕾縱軸高度及單個味蕾中味細胞總數(shù),綜合減小味蕾體積,而且這種作用具有刺激起始年齡差異性,與青春前期小鼠相比,青春期及成年小鼠受咖啡因影響更大。而味蕾體積及味蕾細胞數(shù)量的減少可能導致味覺傳

9、入信息及味覺感受神經(jīng)激活的降低,從而影響動物的飲食行為。
　　 (3)咖啡因長期暴露改變菌狀味蕾甜味感受相關蛋白表達
　　 免疫熒光定量結果表明,長期咖啡因暴露顯著降低所有年齡段小鼠單個菌狀味蕾中α-gustducin陽性味細胞數(shù),與對照組小鼠相比,500 mg/L咖啡因長期暴露后P24、P32及P49天雄性小鼠單個味蕾中a-gustducin陽性味蕾細胞數(shù)分別分別減少約22％、15％和23％,平均減少20％;與雌性小鼠

10、相比,雄性小鼠受咖啡因影響程度更大(P＜0.05),雌性P24/P32/P49天刺激組小鼠單個味蕾陽性味蕾細胞數(shù)分別減少15％、9％和16％,平均減少約13％,所以后期實驗均采用雄性ICR小鼠為實驗對象。與對照組小鼠相比,300 mg/L雄性P24/P32/P49天刺激組小鼠單個味蕾中α-gustducin陽性味細胞數(shù)分別減少約29％、33％和37％,平均減少33％,下降率顯著高于500 mg/L刺激組小鼠(P＜0.05),所以后期實驗

11、中均采用300 mg/L咖啡因暴露濃度。而且上述300 mg/L咖啡因長期暴露對α-gustducin表達影響通過WesternBlot結果得到進一步證實,與對照組小鼠相比,P24,P32,P49三個年齡咖啡因刺激小鼠α-gustducin蛋白表達豐度分別降低約1.43、1.29和1.28倍。同時利用Western Blot技術對PLCβ2、甜味受體T1R2/T1R3及SNAP25的表達豐度分析表明,與對照組小鼠相比,P24/P32/P

12、49天咖啡因刺激組小鼠PLCβ2也呈下調(diào)趨勢,分別下調(diào)約1.35、1.41和1.08倍;但甜味受體蛋白T1R2/T1R3表達豐度呈上調(diào)趨勢,分別上調(diào)3.28/2.18、3.29/1.94和2.55/2.05倍;而對SNAP25表達基本無影響。而且通過比較四種不同刺激物(咖啡因、奎寧、AK及蔗糖)長期暴露對小鼠味覺感受蛋白表達影響結果發(fā)現(xiàn),咖啡因?qū)Ω鞣N味覺感受蛋白表達的影響具有特異性。總之咖啡因長期暴露影響味覺信號轉導蛋白α-gustdu

13、cin(減少)、PLCβ2(減少)、甜味受體蛋白T1R2/T1R3(增加)表達。而且這些影響具有性別及暴露劑量差異性,雄性受影響程度更大,低劑量咖啡因暴露作用更大。
　　 綜合以上三部分實驗結果表明咖啡因長期暴露改變不同年齡段小鼠外周味覺感受器-味蕾解剖形態(tài)(包括減少味蕾最大橫截面及縱軸高度,單個味蕾中味細胞總數(shù)),同時伴隨有味覺感受相關蛋白α-gustducin、PLCβ2表達豐度降低,甜味受體蛋白T1R2/T1R3表達豐度增

14、加,而這些結構與功能的變化可能是咖啡因長期暴露降低甜味偏好的味覺基礎。
　　 (4)咖啡因長期暴露改變小腸不同區(qū)域甜味感受相關蛋白表達及腸道內(nèi)葡萄糖耐受性
　　 長期咖啡因暴露顯著增加小鼠小腸各部分絨毛高度,與對照組小鼠相比,刺激組小鼠十二指腸、中間段空腸及回腸小腸絨毛高度分別增長約8％、6％及3％;而對隱窩深度的影響恰好相反,刺激組小鼠十二指腸、中間段空腸及回腸隱窩的深度分別減少約7％、3％及7％。綜合以上結果,咖啡因

15、暴露組小鼠各段小腸絨毛絨腺比顯著增加,分別增加約9％、9％和10％。免疫共定位結果表明α-gustducin與甜味受體蛋白T1R2/T1R3存在小腸各個部分,而且彼此存在共表達。而Western Blot對上述蛋白表達進行定量分析表明,與對照組小鼠相比,十二指腸、空腸及回腸中甜味受體蛋白T1R2/T1R3表達豐度均顯著呈增加趨勢,分別上調(diào)2.38/1.74倍、1.61/2.17倍和1.71/2.30倍;而α-gustducin表達豐度在

16、十二指腸中呈下降趨勢,空腸及回腸中無顯著變化;咖啡因長期暴露基本不改變下SNAP25在各段小腸中表達。根據(jù)甜味受體及α-gustducin在腸道甜味感受、餐后GLP-1等其他腸道激素分泌調(diào)節(jié)的中作用及我們的研究結果,對禁食葡萄糖灌胃后血漿中GLP-1及胰島素釋放及葡萄糖耐受性進行分析,結果表明與對照組小鼠相比,咖啡因刺激小鼠對葡萄糖存在更高的GLP-1及胰島素分泌,同時受到咖啡因長期暴露的影響,刺激組小鼠葡萄糖耐受性顯著增強。綜上所述咖

17、啡因長期暴露顯著增加小腸絨毛高度,上調(diào)小鼠各部分小腸甜味受體蛋白TlR2/T1R3表達豐度,改變腸道內(nèi)甜味感受生物學基礎;另外咖啡因長期暴露增強GLP-1及胰島素對腸道內(nèi)葡萄糖存在的響應,同時也改變了腸道內(nèi)葡萄糖動態(tài)平衡;但是關于這些改變的相關性還有待于進一步實驗的深入探究。
　　 (5)咖啡因口后攝入作用對口腔味覺感受器特征改變的貢獻
　　 利用口后灌胃與口腔自由飲用咖啡因溶液方式分析咖啡因攝入后作用對味覺外周感受器味