原花青素四聚體干預(yù)變形鏈球菌血清型c體外粘附途徑及機(jī)理研究.pdf

1、長(zhǎng)期研究證明齲病是菌斑在牙齒表面聚集而引起的感染性疾病，變形鏈球菌族(Streptococci mutans以下簡(jiǎn)稱S.mutans)作為人類、動(dòng)物齲病的主要致病因子，對(duì)牙面有高度的選擇性與親和力，在口腔中主要分布于牙面。長(zhǎng)久以來(lái)人們一直試圖采用藥物控制或預(yù)防齲病，但采用的抗生素如青霉素、紅霉素或氟化物等，均表現(xiàn)出一定的局限性，因此，尋找一種使用安全并且能有效調(diào)理口腔菌群平衡的防齲藥物成為研究重點(diǎn)，研究人員開始關(guān)注天然產(chǎn)物防齲的研究?，F(xiàn)

2、代科學(xué)研究表明，茶多酚類物質(zhì)可有效抑制牙菌斑中厭氧菌的生長(zhǎng)。原花青素(Procyanidins，PC)是植物中存在的一類天然多酚化合物，其結(jié)構(gòu)與茶多酚相似，它對(duì)S.mutans的抑菌作用及對(duì)菌株產(chǎn)酸良好的抑制效果為其在臨床預(yù)防治療齲齒，及相關(guān)功能性食品的開發(fā)提供了廣闊的發(fā)展空間，但是有關(guān)原花青素干預(yù)齲齒發(fā)生的主要作用途徑、分子量大小（聚合度）與作用效果的關(guān)系以及作用機(jī)理等尚不清楚。本文以高粱外種皮中幾種原花青素低聚體為研究材料，通過比較

3、原花青素分子量大?。ň酆隙龋┡c抑制變形鏈球菌粘附效果的關(guān)系，篩選高活性抑制變形鏈球菌粘附的原花青素活性成分，在此基礎(chǔ)上，探討其干預(yù)變形鏈球菌粘附的主要途徑并期望闡明其作用機(jī)理。
　　 主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.采用70％乙醇為提取溶劑提取高梁外種皮中的原花青素，經(jīng)ADS-17大孔樹脂純化獲得高粱原花青素（Sorghum procyanidins，SPC）粗提物，由Toyopearl HW-40凝膠色譜分離后結(jié)合紫外

4、分光光度法(UV)檢測(cè)得到SPC不同級(jí)分，結(jié)合ElectrosprayIonization-Mass Spectroscopy(ESI-MS)和Reverse phase high-performance liquidchromatography-Mass Spectroscopy/Mass Spectroscopy(RP-HPLC-ESI-MS)對(duì)SPC和SPC各級(jí)分進(jìn)行分離鑒定。純化后SPC純度為98.5％（正丁醇-鹽酸法測(cè)定），經(jīng)

5、ESI-MS分析發(fā)現(xiàn):SPC主要是由兒茶素/表兒茶素單體、原花青素二聚體、三聚體和四聚體組成的混合物。凝膠色譜分離后的4個(gè)SPC級(jí)分(SPC-U、SPC-Ⅰ、SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ)通過UV和RP-HPLC-ESI-MS/MS分析發(fā)現(xiàn):除SPC-U為黃酮類物質(zhì)外，SPC-Ⅰ、SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ分別為原花青素二聚體、三聚體和四聚體（以下用SPC-Ⅰ、SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ代替）。
　　 2.OD值檢測(cè)結(jié)果表明濃度為1.0 mg

6、/mL的SPC-Ⅰ、SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ均表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制S.mutans Ingbritt(c)在傾斜玻璃表面粘附的能力，與對(duì)照組比較均有極顯著差異(P＜0.01)，其中SPC-Ⅲ的抑制效果最顯著。SPC-Ⅰ濃度范圍:0.01～0.05mg/mL，SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ濃度范圍:0.002～0.02 mg/mL時(shí)，抑制S.mutans Ingbritt(c)在傾斜玻璃表面粘附OD值與對(duì)照組比較均有極顯著差異(P＜0.01)，表明SPC

7、-Ⅰ、SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ皆具有明顯抑制S.mutans Ingbritt(c)在傾斜玻璃表面粘附的濃度效應(yīng)關(guān)系，且測(cè)得IC50值分別為0.033，0.016，0.012 mg/mL，提示SPC-Ⅲ的抑制能力最強(qiáng)。
　　 在此基礎(chǔ)上為進(jìn)一步探求原花青素干預(yù)S.mutans Ingbritt(c)在羥磷灰石(SHA)表面粘附的主要作用途徑，采用熒光標(biāo)記法，同時(shí)設(shè)置NaF作為陰性對(duì)照，結(jié)合制備的SPC粗提物及SPC-Ⅰ、SPC-Ⅱ

8、和SPC-Ⅲ，在7.8125～500.0μg/mL濃度范圍內(nèi)分別處理S.mutans Ingbritt(c)和唾液在羥磷灰石表面形成的獲得性膜，結(jié)果顯示:處理S.mutans Ingbritt(c)時(shí)，隨著5種活性成分濃度的升高，它們對(duì)S.mutans Ingbritt(c)在SHA上的粘附抑制率呈上升趨勢(shì)，其中SPC-Ⅲ的抑制能力最強(qiáng)為67.76％，且在最高4個(gè)濃度時(shí)，各活性成分每個(gè)濃度下的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組比較均有極顯著差異(P＜0.

9、01)，顯示明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系;處理獲得性膜時(shí)，隨著活性成分濃度的升高，表現(xiàn)出一定的濃度效應(yīng)關(guān)系，其中SPC-ⅢH的抑制率最高，但是最高濃度抑制率均低于35％，表明處理獲得性膜時(shí)效果不如處理S.mutans Ingbritt(c)時(shí)明顯。結(jié)果提示原花青素干預(yù)S.mutans Ingbritt(c)在SHA表面粘附的主要途徑可能是通過與菌表面粘結(jié)素作用而產(chǎn)生，尤其SPC-Ⅲ的抑制效果明顯優(yōu)于另外4種藥物。
　　 3.以S.muta

10、ns Ingbritt(c)為實(shí)驗(yàn)菌株，采用60％(NH4)2SO4粗提培養(yǎng)基上清液中菌蛋白，采用等電點(diǎn)沉淀法純化菌蛋白中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransferase，GTFs)，同時(shí)結(jié)合考馬斯亮藍(lán)法、Somogyi法和苯酚-硫酸法進(jìn)行目標(biāo)蛋白的蛋白質(zhì)含量、酶活和產(chǎn)多糖能力的檢測(cè)，得到Initial以及pI為3.10和3.40的3個(gè)組份蛋白。分別經(jīng)過Sepharose6B凝膠柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到In-Ⅰ和In-Ⅱ、3.10

11、-Ⅰ和3.10-Ⅱ以及3.40-Ⅰ和3.40-Ⅱ共6個(gè)蛋白組分，性質(zhì)測(cè)定后推測(cè)其中3.10-Ⅰ更可能是具備GTFs活性的目標(biāo)蛋白組分。通過SDS-PAGE檢測(cè)6個(gè)蛋白組分分子量大小，發(fā)現(xiàn)均是含有35～170 KD不同分子量蛋白的混合物。MALDI-TOF-MS分析3.10-Ⅰ組分170 KD的蛋白條帶，檢索得到的蛋白成分可信蛋白有10個(gè)，其中150 KD左右匹配蛋白有4種，源于與變形鏈球菌同屬變形菌門、β-變形菌綱的其他菌種。
　

12、　 4.紫外光譜結(jié)果顯示隨SPC-Ⅲ溶液濃度的增大，3種類GTFs蛋白（3.10、3.10-Ⅰ和3.10-Ⅱ）的紫外吸收光譜均發(fā)生變化，紅移幅度依次變大，有明顯增色現(xiàn)象，表明SPC-Ⅲ與目標(biāo)蛋白發(fā)生明顯的相互作用。SDS-PAGE結(jié)合MALDI-TOF-MS分析目標(biāo)蛋白之一（3.10-Ⅰ）與4 mg/mL SPC-Ⅲ作用前后位于170 KD處的兩個(gè)蛋白條帶，檢索得到的蛋白成分可信蛋白中有2種分子量為153462 Da和153246 D

13、a的蛋白相同，與變形鏈球菌GTFs蛋白分子量最為接近，推測(cè)其可能與GTFs具有同樣功能或?yàn)槠渲幸环N。雙向電泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）和MALDI-TOF-MS分析類GTFs蛋白（3.10-Ⅰ和3.10-Ⅱ）分別與SPC-Ⅲ作用前后灰度值大的蛋白點(diǎn)，結(jié)果顯示所有差異點(diǎn)均為變形鏈球菌家族中的不同蛋白酶類，其中A24為外膜蛋白，在全細(xì)菌庫(kù)中檢索出，推測(cè)該蛋白是一種同源蛋白或是是以前未在變形鏈