豬鏈球菌血清型液相芯片分型技術(shù)的研究及應(yīng)用.pdf

1、豬鏈球菌血清型分型的方法主要有血清凝集或協(xié)同凝集，但此方法存在費(fèi)時(shí)費(fèi)工，結(jié)果難判斷的缺點(diǎn)。分子學(xué)檢測(cè)方面，至今也僅有針對(duì)血清型1(14)、2(1/2)、7、9型的PCR檢測(cè)方法，隨著疫情的復(fù)雜化和研究?jī)?nèi)容的進(jìn)一步擴(kuò)展，僅有這6個(gè)血清型的檢測(cè)方法已不能滿足需要，而毒力因子篩選的研究?jī)H限于多重PCR，并且不能在一個(gè)體系中完成豬鏈球菌7種主要毒力因子的篩選工作，增加了工作量。本文建立了一種豬鏈球菌優(yōu)勢(shì)血清型分型及主要毒力因子篩選的液相芯片，具

2、體內(nèi)容如下:
　　1.豬鏈球菌優(yōu)勢(shì)血清型分型及主要毒力因子篩選液相芯片的研制
　　本研究首先設(shè)計(jì)并優(yōu)化了豬鏈球菌20種血清型及7種毒力因子的引物，在單重PCR成立的條件下，對(duì)引物、模板濃度以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，最終將豬鏈球菌20個(gè)血清型和7種毒力因子分成了六組多重PCR體系，第一組是血清型1、2、1/2、3、7、9、14;第二組是血清型5、8、12、19、25;第三組是血清型21、27、28、30;第四組是血清型13、15、

3、23、31;第五組是fbps，gdh，orf2，mrp;第六組是sly, gapdh，epf。在前期特異性上游引物5'端加上一段TAG序列，中間用12個(gè)碳橋作為終止信號(hào)，在特異性性下游引物5'端加上生物素(Biotin)設(shè)計(jì)探針引物。用設(shè)計(jì)好的探針引物與帶有Anti-TAG序列的微球進(jìn)行雜交，同時(shí)設(shè)定6個(gè)雜交溫度梯度進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)液相芯片檢測(cè)結(jié)果選擇40℃做為最佳退火溫度，最后進(jìn)行豬鏈球菌血清型分型及主要毒力因子篩選液相芯片的檢測(cè)。并將

4、液相芯片檢測(cè)結(jié)果分別與血清凝集和基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行結(jié)果的一致性評(píng)估分析。通過(guò)敏感性、特異性、重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)液相芯片的性能進(jìn)行驗(yàn)證，顯示各探針引物組合特異性好，與其他細(xì)菌及非體系中的豬鏈球菌沒(méi)有交叉反應(yīng);且最低敏感檢測(cè)濃度為1pg/μL，比普通PCR敏感度高100倍（105pg/μL）;重復(fù)率為98％，大于95％，重復(fù)性良好。
　　2.豬鏈球菌優(yōu)勢(shì)血清型分型及主要毒力因子篩選液相芯片的應(yīng)用
　　運(yùn)用PCR方法與MS技術(shù)從

5、350份臨床樣本中篩選出60株豬鏈球菌，用本研究設(shè)計(jì)的液相芯片技術(shù)對(duì)其進(jìn)行血清學(xué)分型及毒力因子篩選試驗(yàn)，并分別與標(biāo)準(zhǔn)血清驗(yàn)證結(jié)果（血清凝集）和基因測(cè)序進(jìn)行對(duì)比。通過(guò)該試驗(yàn)檢測(cè)出58株豬鏈球菌的血清型，檢測(cè)出的血清型為血清型2、3、5、7、9、21、27，另有2株豬鏈球菌沒(méi)有定型。其中檢出率最高的是血清型2、7、9，分別占26.7％、26.7％、21.7％。毒力因子篩選結(jié)果顯示:同時(shí)含有毒力因子mrp、epf、sly三種毒力因子的菌株為2